Análisis del perfil del transcriptoma
refleja hígado de rata y daño renal después de ultra baja dosis de exposición crónica
Roundup
Robin Mesnage 1, Mateo Arno 2, Manuela Costanzo 3, Manuela Malatesta 3, Gilles-Eric Séralini 4 y Michael Antoniou N. 1 *
1Expresión Génica y Terapia de
grupo de la Facultad de Ciencias de la Vida y Medicina, Departamento de
Genética Médica y Molecular, del Kings College de Londres, octavo piso de la
torre del ala, Hospital Guy, Great Maze Pond, Londres SE1 9RT, Reino Unido
2Genómica Centre, del Kings
College de Londres, Waterloo Campus, 150 Stamford Street, Londres SE1 9NH,
Reino Unido
Departamento de Ciencias Neurológicas y del Movimiento de la
Universidad de Verona, Verona 37134, Italia3
4Instituto de
Biología, EA 2608 y Polo Riesgo, MRSH-CNRS, Explanada de la Paix, de la
Universidad de Caen, Caen 14032, Cedex, Francia
Salud
Ambiental 2015, 14: 70 doi:
10.1186 / s12940-015-0056-1
Recibido:21
de abril 2015Aceptado:11 de agosto 2015Fecha de publicación:25 de agosto 2015
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| Heatmaps de las tres principales funciones biológicas ontológicamente enriquecidos desde el análisis del transcriptoma del hígado y los riñones. Las funciones biológicas ontológicamente enriquecido (Tabla 2) derivada de la alteración en los patrones de expresión de genes comúnmente perturbado en hígado y riñones de ratas hembra tratadas Roundup (Figs. 2 y 3) con respecto con respecto al mRNA de empalme a través de spliceosome (GO: 0000398, en azul), modificación de las histonas (GO: 0016570, en amarillo) y la respiración celular y el ciclo TCA (GO: 0045333 y GO: 0006099, en rosa), se agruparon en heatmaps órgano-específicas utilizando la agrupación jerárquica de las muestras (C, control; R, Roundup) y variables (símbolos de genes). Una clara separación basado en la dirección (hacia arriba o baja regulación) de la expresión génica, la función biológica y órganos entre Roundup tratados y animales de control es discernible |
Fondo
Herbicidas a base de glifosato (GBH) son los principales
plaguicidas utilizados en todo el mundo. Evidencias convergentes sugieren que
GBH, como Roundup, representan un riesgo de salud en particular al hígado y los
riñones, aunque no se han examinado las dosis bajas de relevancia ambiental. Para solucionar este problema,
(/ / dar una ingesta diaria de 4 ng kg pc días del glifosato) se llevó a cabo
un estudio de 2 años en ratas administrando 0,1 ppb Roundup (50 ng / L de
glifosato equivalente) a través del agua potable. Un marcado aumento de la
incidencia de los cambios bioquímicos anatomorphological y sangre / orina era
indicativo de hígado y estructura de los riñones y la patología funcional. Con el fin de confirmar estos
hallazgos que hemos llevado a cabo un análisis de microarrays transcriptoma del
hígado y riñones de estos mismos animales.
Resultados
La expresión de 4224 y 4447 transcripción grupos (un grupo de
sondas correspondientes a un gen conocido o putativo) se encontraron para ser
alterado respectivamente en hígado y riñón (p <0 span=""> q
<0 span=""> Los
cambios en la expresión génica variaban de -3,5 a 3,7 veces en el hígado y
desde -4.3 a 5,3 en los riñones. Entre los grupos de
transcripción 1319 cuya expresión se vio alterada en ambos tejidos, se
encontraron enriquecimiento ontológica en 3 categorías funcionales entre 868
genes. En primer lugar, los genes
implicados en mRNA de empalme y pequeños ARN nucleolar eran en su mayoría
upregulated, lo que sugiere la interrupción de la actividad normal spliceosome. Electron análisis microscópico
de los hepatocitos confirmó nucleolar alteración estructural. En segundo lugar, los genes que
controlan la estructura de la cromatina (N-metiltransferasas especialmente
histona-lisina) fueron principalmente upregulated. Tercero, los genes relacionados
con la compleja cadena respiratoria I y el ciclo del ácido tricarboxílico eran
en su mayoría downregulated. Pathway
análisis sugiere una modulación de las vías de señalización de mTOR y
fosfatidilinositol. Perturbaciones
gen asociado con la administración crónica de ultra-baja dosis Roundup reflejan
una condición hígado y el riñón lipotoxic y el aumento de crecimiento celular
que puede estar vinculado con la regeneración en respuesta a los efectos
tóxicos que causan daño a los tejidos. Alteraciones observadas en la
expresión génica fueron consistentes con la fibrosis, necrosis, fosfolipidosis,
disfunción de la membrana mitocondrial y la isquemia, que se correlaciona con y
así confirmar las observaciones de la patología plantearse en las anatómico,
histológico y nivel bioquímico.
Conclusión
Nuestros resultados sugieren
que la exposición crónica a un GBH (herbicidas basados en glifosato) en un sistema modelo de toxicidad en
animales de laboratorio establecido en una dosis
ultra baja, ambiental puede dar lugar a
daños en el hígado y el riñón con potenciales implicaciones importantes para la
salud de las poblaciones
animales y humanas.
Palabras clave:
Los pesticidas; El glifosato; Transcriptome; Toxicidad crónica; Hígado; Riñón
Herbicidas a base de glifosato (GBH), como el Roundup, son los
principales plaguicidas utilizados en todo el mundo. GBH se aplican actualmente en
al menos el 24% de las tierras de cultivo total mundial (Benbrook C,
comunicación personal), y también se utiliza ampliamente en los ambientes
domésticos y urbanos. Residuos de GBH se detectan de forma rutinaria en los productos
alimenticios [1], [2] y también el agua contaminada a
través de la lluvia, la escorrentía superficial potable y lixiviación en las
aguas subterráneas, lo que aumenta las posibles vías de exposición [3]. Los datos epidemiológicos sobre
la carga corporal humana de los residuos de GBH es muy limitado, pero la
evidencia sugiere que el glifosato y sus metabolitos son muy extendida [4].
Percibida modo primario de glifosato de acción herbicida es
inhibir la sintasa de 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato (EPSPS) de la ruta de biosíntesis
de shikimato aromático presente en las plantas y algunas bacterias de ácido
amino. Desde esta vía está ausente en los vertebrados, se asume
generalmente que el glifosato plantea riesgos para la salud mínimos en
mamíferos, incluyendo humanos [5]. Sin embargo, la evidencia
sugiere que la convergencia de los residuos GBH plantean un riesgo particular
para la función renal y hepática. Efectos hepáticos de glifosato
se observaron por primera vez en la década de 1980, incluyendo su capacidad de
alterar el hígado fosforilación oxidativa mitocondrial [6]. Como glifosato puede actuar
como un protonóforo aumento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial a
los protones y Ca 2+ [7], que puede desencadenar la
producción de especies reactivas de oxígeno dando como resultado el estrés
oxidativo observado [8].Elevación de los marcadores de estrés
oxidativo se detecta en el hígado y el riñón de ratas después de la exposición
subcrónica a GBH en los Estados Unidos permitió la concentración de glifosato
de 700 μg / L en el agua potable [9]. Cambios y alteraciones de la
bioquímica clínica histológicos hepáticos son detectados en ratas que consumen
4,87 mg / kg de peso corporal (pc) glifosato cada 2 días más de 75 días [10].
Estudios metabólicos en una variedad de animales de laboratorio y
de granja muestran niveles de glifosato y ácido aminometilfosfónico (AMPA, el
producto de degradación principal de glifosato) en los tejidos de riñón e
hígado que son de 10 a 100 veces o incluso mayor que los niveles encontrados en
grasa, muscular, y la mayoría de otros tejidos [11]. En los animales de granja, los
niveles urinarios de glifosato elevados se correlacionan con alteraciones en
los parámetros séricos sangre indicativos de estrés oxidativo hepático y renal
y disminución en los niveles de elementos traza de nutrientes[12].
Además de estos efectos citotóxicos, los estudios han sugerido que
GBH puede interrumpir varios sistemas endocrinos de señalización, incluyendo el
estrógeno [13] y ácido retinoico [14]. Endocrinos efectos
perturbadores pueden explicar el deterioro del desarrollo reproductivo en ratas
expuestas a dosis subletales de GBH [15]. Efectos en las vías de
señalización del ácido retinoico se han propuesto para explicar los posibles
efectos teratogénicos de GBH en mamíferos [16] y anfibios [14].
No obstante, debe tenerse en cuenta que la mayoría de los
resultados de estos estudios de toxicidad GBH se obtuvieron a dosis mucho
mayores que la exposición general de la población humana. Las dosis probadas fueron
típicamente sobre la ingesta diaria admisible glifosato (ADI), que actualmente
es de 0,3 mg / kg de peso corporal / día en la Unión Europea y de 1,75 mg / kg
de peso corporal / día en los EE.UU. sobre la base de mediciones de toxicidad
hepatorrenal después de la exposición crónica en ratas, aunque la toxicidad GBH
no se investigó en experimentos de larga duración.
Con el fin de abordar esta cuestión, se realizó un estudio de 2
años en los que se administra a ratas a través de agua potable a una
concentración de 0.1 ppb Roundup, que contiene por lo tanto no sólo el
glifosato sino también adyuvantes [17]. La concentración equivalente de
glifosato fue de 0,05 μg / L y corresponde a una concentración admisible dentro
de la Unión Europea (0,1 μg / L) y EE.UU. (700 μg / L).
Los resultados mostraron que el
Roundup provocó un aumento de la incidencia de signos anatómicos de patologías,
así como cambios en la orina y parámetros bioquímicos sanguíneos sugestivos de
hígado e insuficiencia renal funcional en ambos sexos. En un esfuerzo para confirmar
estos hallazgos a través de un enfoque biológico molecular más cuantitativa y
obtener una idea de las alteraciones en los perfiles de expresión de genes
asociados con el aumento de los signos observados de patologías renales y
anatomorphological hígado, se realizó un análisis transcriptómica completa de
estos órganos de la cohorte hembra de animales. Se encontró un gran número de
grupos de transcripción (> 4000) para ser alterado en su nivel de expresión
tanto en el hígado y los riñones del grupo tratado con Roundup relación con los
controles y con un muy alto significación estadística.Las alteraciones en
perfiles de expresión génica son típicas de perturbaciones medidas en los casos
de fibrosis, necrosis, fosfolipidosis, disfunción de la membrana mitocondrial y
la isquemia. Por lo tanto, nuestros resultados confirman la dosis ultrabaja
Roundup inducida por aumento de la incidencia de patologías hepatorrenal
sugeridos por observaciones en una anatómico, histológico y nivel bioquímico.
Diseño experimental
Los tejidos analizados en este estudio se obtuvieron de los
animales como se describió anteriormente[17]. Brevemente, el protocolo
experimental fue el siguiente. Tras 20 días de aclimatación, 5 semanas de edad ratas Harlan
Sprague-Dawley fueron asignados al azar sobre una base de peso en grupos de 10
animales. Los animales fueron alimentados con la dieta estándar A04 (Safe,
Francia), incluyendo 33% DKC maíz 2675 más de 2 años. Todas las formulaciones de
piensos consistía en una dieta equilibrada, miden químicamente como
sustancialmente equivalente. Todos los animales se mantuvieron en jaulas de policarbonato (820
cm 2, Genestil, Francia). Se cambió periódicamente la
ubicación de cada jaula dentro de la sala experimental. La camada (clásico toplit, Caja
fuerte, Francia) fue sustituido dos veces por semana. Los animales se mantuvieron a
22 ± 3 ° C con una humedad controlada (45 a 65%) y la pureza del aire con un
ciclo de 12 h luz / oscuridad, con acceso libre a comida y agua. Todos los reactivos utilizados
fueron de grado analítico. El protocolo experimental de los animales se realizó de
conformidad con el reglamento de la comisión de ética locales en una unidad de
cuidado de los animales autorizada por los ministerios franceses de Agricultura
y la Investigación (Número de Contrato A35-288-1). Los experimentos con animales
se realizaron de acuerdo a los lineamientos éticos de la experimentación animal
(Reglamento CEE 86/609).
Los grupos de 10 animales tuvieron acceso ni agua corriente
(control) o con la misma agua suplementada con 1.1E-8% de Roundup (0,1 ppb o 50
ng / L de glifosato dilución equivalente). La formulación comercial de
Roundup utilizado fue de Grand Travaux Plus (450 g / L de glifosato, aprobación
2.020.448; Monsanto, Bélgica). El nivel requerido de dilución Roundup en el agua potable se
confirmó mediante medición de la concentración de glifosato por HPLC-MS / MS. Del mismo modo, se estudió la
estabilidad de glifosato en solución y validado durante el período de 7 días
entre dos preparaciones de la prueba, las soluciones de tratamiento. El glifosato y AMPA no se
encontraron en la alimentación en el límite de detección de 5 mg / kg
.
Análisis de toxicidad
Monitoreo dos veces por semana permitió la observación cuidadosa y
la palpación de los animales, registro de los signos clínicos, la
identificación y medición de cualquier tumores, la alimentación y el consumo de
agua, y el peso corporal individual. Medición de las tasas de
mortalidad, anatomía patológica (en 34 órganos diferentes), bioquímica sérica
(31 parámetros) y composición de la orina (11 parámetros) se han descrito
ampliamente [17].
Por microscopía electrónica de transmisión, fragmentos de hígado
se fijaron en pre-refrigerados 2% de paraformaldehído / 2,5% de glutaraldehído
en 0,1 M tampón fosfato salino pH 7,4 a 4 ° C durante 3 h y se procesaron como
se describió previamente [18]. Evaluación de la célula,
citoplasma y el área nuclear, y la relación nuclear-citoplasmática se determinó
a partir de mediciones en 30 hepatocitos por animal. Parámetros nucleares celulares
(% heterocromatina, densidad de poro, área de centros fibrilares, centros
fibrilares%,% componentes fibrilares densos y% de componentes granulares) se
midieron en 10 núcleos por animal.
El muestreo de tejidos y la extracción de RNA
Los animales fueron sacrificados a la misma hora del día durante
el curso del estudio ya sea para cumplir con las regulaciones de bienestar
animal para evitar sufrimientos innecesarios (por ejemplo, resultante de la
pérdida de peso corporal 25%, la presencia de tumores más del 25% de peso
corporal, sangrado hemorrágico, o postración) o en la terminación del período
de estudio de 2 años.Los animales fueron sacrificados por desangrado bajo
anestesia con isoflurano. El hígado se dividió en dos porciones; uno fue broche de congelados en
nitrógeno / hielo seco líquido y almacenados a -80 ° C. Un riñón también se congeló
rápidamente. (Nota: debido al manejo de errores en la compañía empleada para
llevar a cabo el experimento, una muestra de riñón del grupo de tratamiento
Roundup no estaba disponible para análisis).
Rebanadas de sección transversal transversales de hígado y los
riñones fueron procesados para extracción de ARN total usando MagMax-96 para el kit de aislamiento de ARN
total Microarrays (Ambion, Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido).
La hibridación de microarrays
El ARN total (500 ng) se marcó usando desoxinucleotidil
transferasa terminal (TdT) en presencia de un compuesto biotinilado de
propiedad utilizando el kit de transcripción de expresión toda Ambion y toda la
transcripción kit Terminal Etiquetado (Affymetrix UK Ltd., High Wycombe, Reino
Unido), siguiendo protocolos estándar. Empleamos Array ST Affymetrix
GeneChip® Rata Gen 2.0 que contiene aproximadamente 610.400 sondas agrupadas en
214.300 a nivel exón y 26.400 conjuntos de la sonda de nivel de genes. La mediana del número de sondas
por transcripción es 22, por lo general distribuidos a lo largo de toda la
secuencia de transcripción. En general, este microarray cubre 28,407 transcripciones RefSeq
incluyendo transcripciones de codificación de proteínas 16.771 mil. En comparación, la versión 5.0
de la anotación de la rata (cepa BN / SsNHsdMCW) montaje del genoma contiene
30.404 transcripciones incluyendo 22.777 genes que codifican. El análisis se realizó en el
nivel de transcripción grupos. También utilizamos la suite analítica MetaCore para realizar el
factor de transcripción y el análisis de procesos de vía y la toxicidad basado
en objetos de red reconocidos por MetaCore.
Cócteles de hibridación se aplicaron a Affymetrix rata Gene 2.0
microarrays y procesados de acuerdo con el procedimiento
recomendado por el fabricante mediante el sistema de microarrays GCS3000
(Affymetrix). Matriz de datos se exportan como intensidad celular (CEL) archivos
para su posterior análisis.
Análisis de datos de microarrays
CEL archivos se normalizaron juntos en la Expresión paquete de
software de la consola (Affymetrix), utilizando la gama Multi-media (RMA)
algoritmo boceto robusto (a nivel de genes). Los datos de control de calidad
fue evaluada mediante el uso de indicadores y directrices estándar para el
sistema de microarrays de Affymetrix. Archivos de datos normalizados
(archivos CHP) se importaron en ómicas Explorer 3.0 (Qlucore) para su posterior
control de calidad y análisis estadístico. Se decidió incluir todos los
genes en las pruebas ya que no hay medida simple de la presencia / ausencia de
RMA normalizado de datos de Rata Gen 2,0 arrays ST. A pesar de que se arriesga a
una tasa de falso descubrimiento superior, todos los datos recogidos fueron
sometidos a las pruebas estadísticas para no filtrar inadvertidamente genes
importantes en base a un umbral de detección arbitraria. Los datos utilizados para el
análisis funcional se seleccionaron a los valores de corte de p <0 con="" el="" fc=""> 1.1 utilizar grandes listas de genes como
se recomienda [19]. Los-valores q, una estimación de la tasa de falso descubrimiento, fueron los p-valores corregidos mediante el procedimiento Benjamini-Hochberg y estaban
por debajo del 8%.
Gene ontología, vías, redes de genes, de unión al factor de
transcripción y la ontología de la enfermedad se analizó mediante el Reuters
MetaCore suite analítica Thomson reconocer objetos de red (proteínas, complejos
de proteínas o grupos, péptidos, especies de ARN, compuestos entre otros) y / o
en la base de datos del NIH para Anotación, Visualización y Integrados
Descubrimiento Bioinformática Recursos 6.7, reconociendo los genes que
codifican individuales, utilizando recomienda parámetros analíticos [19]. Estos datos de microarrays se
han presentado a genes de Omnibus y son accesibles a través de número de acceso
GSE66060.
La validación de datos de microarrays por tiempo real qPCR
Con el fin de validar la lista de expresados diferencialmente / genes regulados revelados por el análisis de microarrays, se seleccionaron al azar un subconjunto de
18 genes para el análisis por PCR en tiempo real cuantitativa (RT-qPCR) usando
las muestras de ARN originales como material de partida. El ARN total (2 μg) se
convirtió en ADNc con la alta capacidad kit RNA-to-cDNA (Applied Biosystems,
Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido), y mediciones de la expresión de
genes se evaluó mediante RT-qPCR usando ensayos de expresión génica TaqMan y
TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems). Housekeeping genes utilizados
como controles endógenos eran de dos tipos: 1) los genes de limpieza utilizados
históricamente de tres estándares (Gapdh, HPRT1, Actb)(de la lista GeNorm) como uno
de los grupos de transcripción más invariantes de microarrays de datos; es decir, los genes con la
desviación estándar más bajo en todas las muestras pertinentes, y con el nivel
alto o comparable expresión, y 2) Pes1, un gen que no está sexo y / o multi-regulados por hormonas en
estudios en ratas [20]. Métodos Delta Ct se usaron para
normalizar la expresión de los genes seleccionados de interés frente a la media
de los genes de control endógeno. Grupo pliegue cambios log ratio
(relación con los grupos de control) se calcularon utilizando el método de RQ
en el software v3.0 DataAssist (Applied Biosystems).
La selección de tejidos
Los tejidos de hígado de rata y de los riñones que formaban el
material de partida para esta investigación se obtuvieron de animales que
formaban parte de un (2 años) estudio de toxicidad crónica mirando los efectos
del Roundup plaguicidas [17]. Roundup se administró a través
del agua a ratas Sprague-Dawley a beber a una dosis regulatorio admisible (50
ng / L de glifosato dilución equivalente) y que es representativo de lo que se
puede encontrar en el agua del grifo contaminada.A esta dosis, el glifosato
equivalente ingesta diaria promedio de Roundup fue de aproximadamente 4 ng / kg
de peso corporal / día del glifosato.
Los machos sufrieron daño hepático y renal con más intensidad que en
las mujeres, lo que resulta en una mayor tasa de muerte prematura [17]. La mayoría de las ratas macho
fueron descubiertos después de que ocurrió la muerte. Esto dio lugar a la necrosis
del órgano que los hace inadecuados para su posterior análisis y por lo tanto
fueron excluidos de perfiles transcriptoma. Por lo tanto, centramos nuestra
investigación en las hembras que se disponía de los tejidos recién disecados de
cohortes de 9-10 ratas sacrificados tratadas y no tratadas.
Control de la hembra y los animales tratados con Roundup fueron sacrificados,
respectivamente, a 701 +/- 62 y 635 +/- 131 días (archivo adicional 1). El análisis anatomopatológico
de los órganos de estos animales reveló que el hígado y los riñones son los
órganos más afectados [17]. Ratas hembra tratadas con
Roundup mostraron signos 3 veces anatómicas de la patología (15 en 8 ratas) que
el grupo control (6 ratas en 4). Además, suero y orina análisis
bioquímicos mostraron un aumento de los niveles de triglicéridos en suero. Si bien no se detectó daño
renal severa anatómica, análisis bioquímico reveló una disminución en los
niveles de Na, Cl, P y K de sangre y un aumento correspondiente en la orina
sugiere la fuga de iones y la disminución de la creatinina urinaria.Tomados en
conjunto estas alteraciones en la sangre y los parámetros bioquímicos urinarios
sugieren un deterioro de la función renal. En general, el doble del número
de parámetros bioquímicos fue perturbado en el riñón que lo que se puede
esperar por azar. Además, un desequilibrio de testosterona / estrógeno era evidente
con los niveles séricos de testosterona aumentó significativamente en un 97% en
comparación con los controles, mientras que los niveles séricos de estradiol se
redujeron en un 26%. Estas observaciones, junto con alteraciones de la glándula
pituitaria sugieren efectos de alteración endocrina.
Electron análisis microscópico de secciones de hígado de estos
animales mostraron interrupción nucleolar en los hepatocitos (Fig. 1). Hubo un aumento
estadísticamente significativo de la célula y el área citoplasmática. No se observaron daños
estructurales importantes celular. Sin embargo, el análisis de
morfometría nuclear mostró que los hepatocitos de ratas hembra tratadas con
Roundup tenían un contenido estadísticamente significativa mayor
heterocromatina, un componente fibrilar denso reducida y un aumento
concomitante en el componente granular en comparación con los controles que
indican una alteración de la función nucleolar y en general disminución del
nivel de la transcripción (Fig. 1a). Además, una dispersión
citoplásmica de glucógeno también se observó en el grupo tratado Roundup (Fig. 1b).
Fig. 1. Las alteraciones en la
arquitectura nuclear de hepatocitos en ratas tratadas con Roundup femeninos
sugiere alteraciones transcripcionales.Hepáticas de control (C) y Roundup (R)
tratados ratas hembra se sometieron a un análisis microscópico de electrones
ultraestructural para investigar la arquitectura subcelular. Una cuantificación de análisis morfométrico de los
hepatocitos que revelan alteraciones en subnuclear (heterocromatina, fibrilar
denso, granular) compartimentos indicativo de una reducida estado
transcripcional. Los parámetros morfométricos están representados por su media y su
desviación estándar. Unaprueba t no pareada de dos colas fue utilizado como prueba estándar para
las comparaciones estadísticas (*** p <0 span=""> B micrografías electrónicas
representativas que comparan los hepatocitos de control (panel superior) y (panel inferior) ratas tratadas con Roundup que
muestran una interrupción de la dispersión de glucógeno (G). N núcleo, r retículo endoplasmático rugoso
Patrones Transcriptome segregan muestras de hígado y riñón basado
en el tratamiento Roundup
En un intento de confirmar los efectos anatomopatológicos de una
manera más cuantitativa y para comprender mejor los perfiles de expresión de
genes que están asociados con los signos de la patología observada en el hígado
y los riñones, se realizó un completo análisis de microarrays transcriptoma de
estos órganos. Empezamos por llevar a cabo una supervisión Análisis de
Componentes Principales (PCA) del conjunto de datos, lo que reduce un perfil de
alta dimensión de expresión a las variables individuales (componentes) de
retención mayor parte de la variación (Fig.2a). Como control y los animales
tratados con Roundup fueron sacrificados a diferentes edades, que inicialmente
se realizó un análisis de PCA donde los animales individuales fueron ordenadas
por edad (más antiguo vs más joven), para determinar si las diferencias en los
perfiles de transcriptoma correlacionan con este parámetro (archivo adicional 2). Esto demostró que los valores
de control estadísticos fueron débiles, sin segregación de los animales más
viejos y más jóvenes en el control o grupos tratados con Roundup, lo que indica
que la edad no era una fuente importante de diferencia.Por el contrario, se observó
una separación clara entre el control y las ratas tratadas con Roundup sobre la
base de tratamiento (Fig. 2a; Archivos adicionales 3 y 4). Incluso si los principales
componentes sólo representan ~ 30% de la variación observada, lo que parece
bastante bajo, esta visión de alto nivel de los datos mostró una segregación
homogénea y una baja variabilidad intragrupo, así como la ausencia de valores
atípicos. Cifra 2b muestra la significación
estadística (por pruebas t de Student) de la expresión diferencial de clúster
transcripción por parcelas volcán junto con los respectivos cambios veces (FC)
(Fig. 2b), donde un grupo transcripción
constituye un grupo de clusters exón (exón cada grupo compuesto por diferentes
sondas) que corresponde a un gen conocido o putativo. En general, los cambios de
expresión génica variaron -3,5 a 3,7 veces en el hígado y -4,3 a 5,3 en los
riñones. La expresión de 57 y 226 grupos de transcripción nos molestó,
respectivamente, en hígado y el riñón a través de una FC de 2. AKR1B1 (FC de - 4,3, p = 2.2e - 5) y Ten1 (FC de - 3,5, p = 7.3E - 4) fueron los genes más regulados abajo, respectivamente, en el
hígado y los riñones Las transcripciones mayoría hasta reguladas eran pequeños
RNAs nucleolar (snoRNAs), ENSRNOT00000053015 en el hígado (FC = 3,7; p = 3.0E-6) y ENSRNOT00000068958en los riñones (FC = 5,3, p = 8.6E-7). Se observó significación estadística Grande (p-valores hasta 2.3E-10 en el hígado). Un gran número de grupos de
transcripción se altera significativamente por debajo de los umbrales estrictas q-valor (tabla 1). Además, el análisis estadístico
de muestras aleatorias simuladas confirma que el grado de diferencia
estadística entre los grupos control y de tratamiento Roundup son mucho mayores
que lo que se puede esperar por azar (Tabla 1).
Fig. 2. Amplia escala perfil
transcriptoma alteración en el hígado y los riñones de las ratas hembras
tratadas con Roundup. Hígado y los riñones de las ratas y los animales de control
reciben 0,1 ppb Roundup (50 ng / L glifosato dilución equivalente) en el agua
potable se sometieron a un análisis completo de microarrays transcriptoma. Un análisis PCA de los perfiles de
expresión de clúster transcripción muestra una clara separación en grupos de
tratado ( rojo) y control (verde) ratas en ambas muestras de riñón e hígado.Números de puntos de
datos denotan la edad al momento de la muerte en el día. Parcelas bVolcán de los perfiles de hígado y riñón transcriptoma que
muestran los log 2 veces los cambios y las -log10 p-valores en la expresión grupo transcripción inducida por la exposición
Roundup en comparación con los controles. Los datos fueron seleccionados
en los valores de corte de p<0 cambio="" doble="" y=""> 1.1. Los puntos rojos representan genes comúnmente perturbado entre las muestras de
hígado y riñón
Tabla 1. Número de grupos de
transcripción cuya expresión se altera en diferentes umbrales de corte valores de p
Los datos utilizados en el análisis funcional se seleccionaron a
los valores de corte de p <0 span="" y=""> q<0 con="" el="" fc=""> 1.1 para
su uso con grandes listas de genes como se recomienda previamente[19]. Un diagrama de Venn comparando
los perfiles de expresión de clúster de hígado y riñón de transcripción en un
FC> 1.1 (Fig. 3a) indica que aunque la mayoría de
los disturbios eran tejido específico, 1319 transcripción grupos fueron
perturbados comúnmente entre los dos órganos. Una comparación en una corte
umbral seleccionado frecuencia del FC> 2 resultados de nuevo con la mayoría
de los cambios en la expresión génica ser específico a cualquiera de hígado o
riñón, pero con un total de 20 genes se altera comúnmente en ambos órganos
(Fig. 3b). El FC, p-valor y q-valor para todos los genes cuya
expresión se altera comúnmente en el hígado y el riñón se muestran en archivo
adicional 5.
Fig. 3. amplio espectro de expresión
grupo transcripción es perturbado comúnmente en el hígado y el riñón por
Roundup. Diagramas de Venn número de genes alterados comúnmente en el
hígado y los riñones mostrando como lo revela el análisis del transcriptoma en
corte de los valores de umbral de p <0 cambio="" doble="" y=""> 1.1 (a) y> 2 (b)
De estos, 18 genes fueron seleccionados al azar para la validación
de los resultados de microarrays por RT-qPCR (archivo adicional 6). El patrón general de los
resultados de RT-qPCR confirmó los datos de microarrays con el 86% de los genes
que se encuentran para ser similar altura o hacia abajo-regulada por ambos
métodos.
La función de genes implicados en las alteraciones de la
respiración mitocondrial, la función spliceosome y modificación estructura de
la cromatina se asocia con el tratamiento Roundup
A continuación realizamos un análisis ontología de los 1319 grupos
de transcripción comúnmente desregulados en el hígado y el riñón con la función
de clasificación funcional de genes DAVID para revelar los más afectados
categorías de genes. Como resultado fueron reconocidos 868 genes. Los 8 grupos de perturbaciones
funcionales que tienen puntuaciones de enriquecimiento más de 2 se presentan en
la Tabla 2. Todo tiene p-valores significativos y Benjamini corrigió valor p (q-valores).Se identificaron un total de 3
principales redes de genes afectados.
Tabla 2. agrupación funcional de genes
derivados utilizando el gen herramienta de clasificación funcional DAVID
En primer lugar, dos grupos estaban relacionados con la función
spliceosome. Esto incluye genes que codifican escisión y poliadenilación
factores específicos (Cpsf2, CPSF3 y Cpsf7), ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (Hnrnpl, Hnrnpf) y factores de empalme (Sf3b5, Sf3a1). La expresión de todos estos genes se upregulated con la excepción
de CPSF3. Otros genes implicados en el
empalme de ARN, tales como Luc7l3, Pnn, Prpf4b, Pnisr,
Prpf39, Srek1, Ddx39b y Ddx39a, se upregulated
significativamente. Además, la expresión de al menos 160 snoRNAs no codificantes se
encontraron para ser alterado con casi todos se upregulated con una gran FC de
hasta 5,32 para los riñones ENSRNOT00000068958in. En segundo lugar, dos grupos
consistían en miembros de la familia modificación de la cromatina de las
enzimas, en particular, N-metiltransferasas de histona-lisina.Expresión de los
7 genes (MEN1, Setdb1, Suv420h2, Dot1l,
Ehmt1, Ehmt2, NSD1) que pertenecen a este grupo se reguló. Otros genes con una ontología
relacionada (mLL2, Mll4, Tet3, Baz2a,
Dnmt3a, Brd1, Brd4, Ino80d o Arid4b), que no se tienen en cuenta en
el conjunto de las funciones biológicas enriquecidas, también se upregulated. La mayoría también pertenecen a
la familia de los complejos de N-metiltransferasa de histona-lisina que los
residuos de lisina específicamente metilato de la histona H3 (Lys-4, 9, 20 o
79) o H4 (Lys-20), entre otros, el etiquetado de ellos por condensación de la
cromatina. Además, la mayoría de ellas también se incluyen en un clúster
perturbada mayor de 40 genes implicados en la regulación negativa de los
procesos de biosíntesis de macromoléculas.
En tercer lugar perturbación, funcional de genes implicados en el
metabolismo mitocondrial fue representado por dos clusters, especialmente
relacionados con la cadena respiratoria complejo I y el ciclo TCA. La expresión de la mayoría de
estos genes fue reprimida. Un total de 7 genes que codifican NADH deshidrogenasa (ubiquinona)
complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial se encontró perturbado, con 6
de ellos se downregulated. Además, se downregulated los genes que codifican deshidrogenasas
isocitrate (Idh3B y Idh3g), succinato deshidrogenasa (SDHC), ligasas-succinato CoA(Sucla2 y Suclg2) y sintasas ATP complejos F1 mitocondrial (Atp5b y Atp5d). Estos datos sugieren que las
actividades de los complejos mitocondriales, en particular, la actividad
respiratoria, están deprimidos.
Estos 3 principales funciones biológicas enriquecidas son
presentados por los mapas de calor órgano-específicas utilizando la agrupación
jerárquica de las muestras (Fig. 4). Nuestros resultados muestran
genes relacionados con la respiración mitocondrial y el ciclo TCA son
reprimidos en su mayoría, mientras que los que participan en mRNA de empalme y
la modificación de las histonas son upregulated.
Fig. 4. Heatmaps de las tres principales
funciones biológicas ontológicamente enriquecidos desde el análisis del
transcriptoma del hígado y los riñones. Las funciones biológicas
ontológicamente enriquecido (Tabla2) derivada de la alteración en
los patrones de expresión de genes comúnmente perturbado en hígado y riñones de
ratas hembra tratadas Roundup (Figs. 2 y 3) con respecto con respecto al
mRNA de empalme a través de spliceosome (GO: 0000398, en azul), modificación de las histonas (GO: 0016570, en amarillo) y la respiración celular y el ciclo TCA (GO: 0045333 y
GO: 0006099, en rosa), se agruparon en
heatmaps órgano-específicas utilizando la agrupación jerárquica de las muestras
(C, control; R, Roundup) y variables (símbolos de genes). Una clara separación basado en
la dirección (hacia arriba o baja regulación) de la expresión génica, la
función biológica y órganos entre Roundup tratados y animales de control es
discernible
Cambios Roundup asociadas pueden ocurrir a través de las vías de
señalización de hormonas sexuales
El análisis de ontología de genes (Tabla 2) indica una modulación de vías de señalización celular ha tenido
lugar. Los procesos biológicos GO GO: 0007264 "pequeña señal GTPasa
mediada transducción" (21 genes, p = 1.2E-3, q = 1.2E-1) y GO: 0007242 "cascada
de señalización intracelular" (57 genes, p = 2.2E- 3, q = 1.7E-1) se enriquecen entre los
genes comúnmente perturbado en el hígado y los riñones. Además, las redes de relieve por este
análisis que puede dar cuenta de la alteración en la expresión génica se
centraron en los factores de transcripción Creb1 (280 genes regulados, p ~ 0), c-Myc (159 genes regulados, p ~ 0), YY1 (113 genes regulados, p<4 .8e-234="" 4="" class="apple-converted-space" genes="" oct3="" regulados="" span=""> p <6 .7e-194="" class="apple-converted-space" esr1="" genes="" regulados="" span="" y=""> p <8 .e-171="" adicional="" archivo="" span="">
7). Estos factores de transcripción están íntimamente relacionados en
la regulación de la expresión génica y pueden estar involucrados en las vías de
señalización de la hormona.
En este contexto, cabe destacar que el gen que codifica el
receptor de andrógenos es estadísticamente significativamente downregulated en
el hígado (FC = -1,4, p = 8.1e-3, q = 7.7E-2) y los riñones (FC = -1,32, p = 2.9E-3, q = 3.8E-2). Además, el gen beta del receptor de
retinoide X(RXRB) está regulada
positivamente de manera significativa en el hígado (FC = 1,2, p =
3.5E-5, q = 3.2E-3) y los riñones (FC = 1,36, q = 4.5E-6, q = 1.2E-3). Además, la anotación KEGG para la vía
de señalización mTOR (14 genes, p = 6.4E-3, q = 0,21) y el sistema de señalización
fosfatidilinositol (16 genes, p = 1.3E-2, q = 0,29) se enriquecen en el hígado . En el riñón, la anotación KEGG para la
vía de señalización adipocytokine (que implica mTOR) (19 genes, p = 2.4e-3, q = 0,06) y el sistema de señalización
fosfatidilinositol (21 genes, p = 6E-4, q = 0,05) son enriquecido. Sin embargo, la expresión de la estrella, que ha sido sugerida por estudios
previos para mediar endocrino efectos de Roundup en las células tumorales de
Leydig MA-10 interrumpiendo[21], y deESR1, ESR2 y aromatasa (CYP19A1), que fueron encontrados perturbado en
la línea celular de hepatocitos HepG2 humana[22], no se han encontrado para ser
dysregulated en esta investigación.
Las
alteraciones en el perfil del transcriptoma sugieren hígado y el riñón
anatomorphopathogy
Puntaje mapas de rutas y procesos de toxicidad (Fig. 5) indica que múltiples funciones celulares podrían estar
involucrados. De los grupos de transcripción 4224 hepáticas y renales 4447 se
encuentran para ser alterado, 2636 y 2933, respectivamente, fueron objetos de
red reconocidos por GeneGo MetaCore. Vías
asignadas relacionadas con respuestas inflamatorias, que pueden ser los
resultados secundarios a daño de órganos, se enriquecen (por ejemplo, los que
implican NF-kappa B o la señalización de CD28). Varias vías asociadas con el
citoesqueleto también se enriquecen, sugerente de un cambio en el crecimiento
celular en un esfuerzo por superar los efectos tóxicos y para regenerar los
tejidos dañados. En este sentido,
el enriquecimiento de la proinsulina péptido C vía de señalización en el hígado
(14 genes, p = 2.4e-5, q = 1.2E-3) la participación de mTOR y
la fosfatidilinositol sistemas de señalización es de destacar ya que tiene un
papel establecido en la proliferación celular y el metabolismo de los lípidos. Otros mapas confirmaron la inducción
de vías de señalización intracelular y una influencia en el equilibrio entre la
proliferación y la apoptosis. La
regulación de la traducción por la actividad eIF4F (16 genes, p = 1.2E-6, q = 8.1e-5), otra función mTOR regulada,
también está perturbado.
Fig. 5. Toxicidad análisis de ontología de genes alterados en el hígado y
los riñones de las ratas tratadas con Roundup. Lista de los mejores de la vía y de
proceso toxicidad redes 10 de puntuación revelados por el análisis de los
perfiles de MetaCore hígado y riñón transcriptoma femeninos recibir 0.1 ppb de
Roundup en el agua potable (p <0 .01="" cambios="" doble=""> 1,1). Los p-valores se determinan por cálculo hiper
geométrica
Además, el GO "proceso metabólico" y "respuesta
celular al estrés" procesos tienen bajos p-valores en el hígado (respectivamente p =
3.7E-58 y 3.9E-16) y los riñones (p = 1.5E-49 y 1.0E- 14), que sugieren
fuertemente un estado de estrés metabólico. En
general, el análisis de procesos toxicidad reveló alteraciones de expresión de
genes asociados con la apoptosis, necrosis, fosfolipidosis, disfunción de la
membrana mitocondrial y la isquemia. Así,
la alteración en el perfil del transcriptoma identificado en este estudio se
correlaciona con el aumento de los signos observados de la patología anatómica
y funcional del hígado y los riñones.
Presentamos aquí la primera en la investigación transcriptoma vivo
en una especie de mamífero siguiente a largo plazo (2 años) la exposición a un
GBH agrícola (Roundup) en una dosis relevante para el medio ambiente. Nuestros resultados confirman la mayor
incidencia de patologías hepáticas y renales descritos en una
anatomorphological y nivel bioquímico en sangre / orina en ratas hembras
administrados con Roundup en el agua potable a un / concentración equivalente L
glifosato regulatorio admisible, ultra baja dosis de 50 ng [17].Los niveles de consumo de
glifosato fueron aproximadamente 4 ng / kg de peso corporal / día, que son muy
por debajo de los valores de ADI globales. Se
ha observado una gran escala, alteración asociada al tratamiento en patrones de
expresión génica en una alta significación estadística tanto en el hígado y los
riñones (Figs. 2 y 3;Mesa 1). Gene ontología análisis de estas alteraciones del transcriptoma
está vinculado con un marcado cambio en la respiración mitocondrial, la
actividad spliceosome, estructura de la cromatina y las vías de señalización de
la hormona (Tabla 2). Colectivamente,
las alteraciones en la expresión de genes (Fig. 4) están asociados con una desregulación de la homeostasis del
tejido en el nivel de equilibrio de la proliferación de apoptosis (Fig. 5) y por lo tanto se correlaciona bien con el aumento de los
signos de hígado y riñón anatómica, histológica y sangre / orina bioquímica
patologías descritas en estos animales [17]. También hay que resaltar es que las alteraciones Roundup tratos
asociados en los patrones de expresión de genes que observamos no corresponden
a transcriptome firmas de necrosis hepática provocada por hepatotóxicas agudas [23].
Siguiendo el enfoque analítico recomendado para grandes conjuntos
de genes [19], se observó un gran número (> 4000)
cuya expresión se alteró tanto en el hígado y los riñones en el grupo de
tratamiento Roundup (Fig. 3a). En la mayoría
de los casos, el cambio en el nivel de la transcripción estaba por debajo de 2
veces (Fig. 3a y b) pero en un grado estadísticamente muy significativa (p<0 class="apple-converted-space" span=""> Estas observaciones implican que las
bajas pero constantes cambios en la expresión de un gran número de genes pueden
proporcionar suficiente resolución estadística ser informativo con respecto a
cualquier patología órgano que pueda estar presente.
Sin embargo, dado el gran número de funciones de genes alterados
tanto en el hígado y los riñones en el grupo de tratamiento Roundup, esto
representa una combinación de efectos resultantes de la patología de estos
órganos, así como un impacto directo del plaguicida. Así, no es posible a partir de nuestra
investigación para distinguir definitivamente los efectos primarios de Roundup
en el hígado y riñón transcriptoma de los efectos secundarios sobre la
expresión de genes derivados de la patología presente en estos órganos. Sin embargo, la cohorte más pequeña de
genes que se encuentran comúnmente perturbado en hígado y riñón (fig. 3; Archivo adicional 5) puede dar una idea de los sistemas que pueden ser los objetivos
principales de este herbicida (Tabla 2).Nuestros resultados ponen de
manifiesto la necesidad de futuros estudios de toxicidad GBH donde
transcriptoma órgano se determina antes de la aparición de las patologías
hepáticas y renales evidentes observadas en la terminación de la última etapa,
como en este caso. Perturbaciones
Así transcriptoma que en última instancia puede conducir a las patologías de
órganos posteriores etapas se pueden identificar.Además, la relevancia clínica
de nuestras observaciones Queda por examinar, en particular, ya que hay pocos
datos disponibles sobre los niveles de glifosato en los seres humanos [4].
Los resultados de los estudios en los ratones fueron alimentados
con dietas que contenían Roundup-tolerantes soja transgénica [18], [24] son consistentes con nuestras
observaciones. Animales mostraron
alteraciones en la arquitectura nuclear de hepatocitos, disminución de la
expresión de ciertas enzimas respiratorias, una alteración de la actividad de
empalme y marcado aumento de envejecimiento hígado. Además, observaciones similares se
realizaron con hepatocitos de rata tratados con Roundup in vitro[25], lo que
sugiere que las alteraciones en la función mitocondrial nucleolar y pueden ser
un efecto primario directa de este herbicida.
Estudios previos, aunque las dosis mucho más altas, han demostrado
que el glifosato puede desacoplar la fosforilación oxidativa mitocondrial de
hígado [6] e inducir la permeabilización de la
membrana no específico y un agotamiento de los índices respiratorios de
succinato-dependiente en mitocondrias aisladas de ratas [26]. El modo de inhibición al glifosato de la EPSPS en plantas es por
inhibición competitiva de la fosfoenolpiruvato (PEP) la unión del sustrato en
el sitio activo de la enzima [5].Enzimas PEP unión son reguladores
del metabolismo de la energía, en particular a través del ciclo de Krebs. El glifosato fuera de objetivo efectos
pueden incluir la interrupción de estas enzimas. De hecho, el glifosato puede
interactuar en el sitio de unión al sustrato y potencialmente inhibir la
succinato deshidrogenasa mitocondrial [27]. Además, como pequeñas moléculas quelantes de zinc pueden perturbar
el montaje spliceosome y la actividad de las enzimas de la cromatina
modificación [28], el glifosato puede también han
ejercido efectos directos sobre la función spliceosome debido a sus propiedades
quelantes de metales (Patente No: US 3.160.632;[29]).
El aumento de la incidencia de patologías hepáticas y renales
asociadas a Roundup [17] confirmó
en este informe puede ser derivado de múltiples fuentes como cada vez hay más
pruebas que sugieren que GBH y el glifosato puede producir efectos tóxicos a
través de diferentes mecanismos, dependiendo del nivel de exposición. Sin embargo, los efectos tóxicos han
sido registrados en la mayoría de los casos a niveles de glifosato y / o
exposiciones GBH[10],[15] muy por encima de la dosis ultra-baja
se administra a los animales en esta investigación. Así, es difícil atribuir
definitivamente uno o más mecanismos de toxicidad observados en estos niveles
de dosis superiores a las patologías hepáticas y renales observados en nuestro
estudio. No obstante, nuestra
observación de una importante acumulación de snoRNAs tanto en hígado y los
riñones del grupo tratado con Roundup (Fig. 3, Tabla 2) admite la posibilidad de daños derivados de estrés oxidativo ya
que se sabe que desempeñan un papel crítico en la amplificación de los efectos
de las especies reactivas del oxígeno y la oxidación aguas abajo lesión tisular
mediada por el estrés [30]. El estudio de Michel y sus colegas demostró la inducción de la
expresión snoRNA como un vínculo funcional entre el progreso de la muerte
celular lipotoxic y la respuesta celular al estrés oxidativo nocivo [30].Lipotoxicidad se manifiesta como
estrés oxidativo mejorada y como la señalización proinflamatoria elevada, a
menudo se asocia con la acción anormal de insulina [31]. Es
de destacar que hemos encontrado alteraciones en las vías asociadas con estos
procesos biológicos en nuestro estudio (Fig.5).
Además, el análisis de las vías reveló alteraciones en la modulación
de la mTOR y sistemas de señalización fosfatidilinositol, ambos vinculados a la
regulación de la síntesis de lípidos entre otras funciones celulares
importantes [32]. Fosfoinositida
3-quinasa transduce señales procedentes de diversos factores en mensajes
intracelulares por fosfolípidos de generación, la interrupción de los cuales es
uno de los principales procesos de punto final de toxicidad observados en el
hígado y los riñones en este estudio (Fig. 5). En
general, estos resultados sugieren una implicación del estrés lipotoxic
asociada con el estrés oxidativo y la señalización proinflamatoria elevada, que
es una característica de hígado crónica y la enfermedad renal [33].
Condiciones lipotóxico crónicas en nuestro estudio también se ven
corroboradas por el análisis que muestra aumento de los niveles de
triglicéridos séricos bioquímicos [17]. En
algunas circunstancias, el exceso de ácidos grasos libres inducen la muerte
celular apoptótica [33].Nuestro análisis también indica
cambios en las vías intracelulares subyacentes posiblemente un cambio en el
crecimiento celular, tales como el péptido C de la proinsulina vía de
señalización, así como la mTOR y la fosfatidilinositol sistemas de
señalización. Homeostasis tisular
depende de un delicado equilibrio entre la apoptosis y proliferación celular. Cuando el estrés oxidativo provoca
apoptosis, las células dañadas son reemplazadas generalmente a través de
aumento de la proliferación. Curiosamente,
resultados similares han sido recientemente reportado donde el análisis del
transcriptoma de la trucha marrónexpuestos a
glifosato o Roundup a una concentración (10 μg / L) se encuentran típicamente en
el medio ambiente, reveló una sobre representación de vías involucradas en el
estrés oxidativo, apoptosis, y el regulación de la proliferación celular[34]. Sin
embargo, aunque hay evidencia para sugerir que el glifosato puede inhibir
múltiples funciones celulares tales como la respiración mitocondrial, y
actividades enzimáticas distintas de EPSPS dentro de la vía de shikimato, la
existencia de tales mecanismos directos de interferencia a la dosis ambiental
bajo prueba aquí Actualmente sigue siendo desconocida y por lo tanto necesita
una mayor exploración.
El desequilibrio de proliferación / apoptosis también puede haber
sido ya sea causado o promovida por una interrupción crónica del sistema
endocrino y la activación o represión de las vías de señalización. La activación de fosfoinosítido 3-quinasa
(PI3K) por las hormonas tales como estrógenos[35] resulta en una regulación a la baja
mundial de los genes que codifican los miembros del ciclo de Krebs y la
fosforilación oxidativa, la mitocondria defectuosa, y la reducción de la
respiración [36]. Las hormonas y sus receptores nucleares tienen interacciones
dinámicas con los complejos de remodelación de la cromatina y la función
spliceosome [37]. Como
hemos observado una perturbación en estrógenos / testosterona equilibrio y
disfunción pituitaria en los animales estudiados aquí [17], una relación entre los patrones de
expresión de genes alterados y patologías a través de un mecanismo perturbador
endocrino es plausible, sobre todo porque endocrinos efectos perturbadores
pueden ocurrir a dosis muy bajas [38]. Además, las mejores puntuaciones redes factor de transcripción que
pueden explicar las alteraciones asociadas al Roundup observados en la
expresión génica que se presenta aquí se centran en Creb1, ESR1, YY1, c-Myc y
Oct3 / 4 (Fig. 4), que cooperan para regular la expresión génica después de la
estimulación hormonal [39]. El desequilibrio hormonal se asocia generalmente con insuficiencia
renal o hepática [40]. Además,
el glifosato se ha encontrado para actuar como un agonista de estrógenos en
ensayos de células de cáncer mamario humano estimular el crecimiento en
concentraciones comparables a la hormona nativa [13], [41]. Este potencial
estrogénico del glifosato puede haber contribuido a la tendencia en el aumento
de la incidencia de tumores mamarios en las ratas tratadas con Roundup
analizado en esta investigación [17].
Una consideración importante es que el Roundup no es un solo
compuesto, sino una mezcla de un ingrediente activo (glifosato) en combinación
con diversos adyuvantes, que son necesarios para estabilizar y permitir la
penetración del glifosato en las plantas. En
exposiciones agudas a corto plazo, algunos adyuvantes pueden ser considerados
como responsables de la toxicidad de Roundup [42].Sin embargo, como la
composición adyuvante es propietario y no totalmente descrita, no es posible
atribuir la toxicidad de la formulación total herbicida agrícola para un
componente dado. Así, los
resultados de nuestro estudio no son directamente comparables con otras pruebas
glifosato solo. Los resultados
que presentamos pueden ser específicos para la formulación estudiada, ya que la
toxicidad de diferentes adyuvantes GBH puede variar en un factor de al menos
100 basado en ensayos que implican un 24 h de exposición a las células de
cultivo de tejidos humanos [42]. Los estudios futuros que implican la administración de glifosato
solo sería arrojar luz sobre esta cuestión.
En resumen, se detectaron las alteraciones en el perfil del
transcriptoma muy por debajo del glifosato IDA (0,3 mg / kg de peso corporal /
día) establecido en la Unión Europea, y se encuentra dentro del rango admitido
en el agua potable (0,1 ppb) y productos alimenticios (por ejemplo, 20 ppm en
soja GM o 2 ppm en los riñones de la especie bovina). Como disruptor endocrino probable, GBH
/ glifosato puede alterar el funcionamiento de los sistemas hormonales y perfiles
de expresión génica a través de diferentes mecanismos, dependiendo de la dosis. Futuros estudios metabolómicos y
proteómicos de estos órganos podrían proporcionar una mayor comprensión
mecanicista en el proceso patológico mediado por Roundup observado.
Se sabía con anterioridad que el consumo de glifosato en agua por
encima de los límites autorizados puede provocar insuficiencia renal y
problemas reproductivos [43]. Los
resultados del estudio presentado aquí indican que el consumo de niveles mucho
más bajos de una formulación GBH, a concentraciones de glifosato equivalente
admisibles, se asocian con alteraciones a gran escala del transcriptoma hígado
y el riñón que se correlacionan con los signos observados de anatomorphological
hepática y renal y cambios patológicos bioquímicos en estos órganos [17].Además, como la dosis de Roundup
se determinó que es relevante para el medio ambiente en términos de humano [4], animales domesticados[12] y la
vida silvestre [34], [44] los niveles de exposición, nuestros
resultados tienen implicaciones potencialmente importantes para la salud de las
poblaciones animales y humanas. Además,
los datos también sugieren que los nuevos estudios que incorporan principios de
pruebas de endocrinología y de desarrollo epigenética, en particular, para
evaluar la endocrina capacidad disruptiva de GBH / glifosato, se debe realizar
para investigar las posibles consecuencias de la exposición a dosis bajas
durante la vida temprana, así como en los adultos.
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Autores
de las contribuciones
RM realizó el análisis estadístico, interpreta los datos
transcriptoma, y redactó el manuscrito. MA
llevó a cabo el experimento transcriptoma y ayudó con la interpretación de los
datos. CM y MM realizan e
interpretan el análisis de microscopía electrónica. GES concibió la prueba de alimentación
de los animales y proporciona tejidos para su análisis. MNA y GES concibe el estudio. MNA coordinó la investigación y
redactó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Archivo adicional 1 :. Metadatos. Metadatos de las muestras de hígado y riñón utilizados para el
análisis de microarrays incluyendo la edad de las ratas en el momento de la
muerte a través de la eutanasia. (XLSX
10 kb)
Archivo adicional 2 :. Análisis PCA
no revela una correlación entre las alteraciones en el perfil del transcriptoma
y la edad en el momento de la muerte. Los grupos
de 5 ratas de control y categorías de tratamiento Roundup fueron generados de
manera que 5 animales con un tiempo antes de la muerte (esferas amarillas) se
compararon con 5 que fueron sacrificados en un último punto de tiempo (esferas
de color púrpura) en un análisis de PCA. No se observaron diferencias
significativas en los perfiles de expresión de racimo transcripción sobre esta
base con muestras de principios y puntos de tiempo de muerte siendo este último
entremezclados. Por ejemplo, para
el hígado, el perfil de transcripción expresión grupo de 10 ratas con un punto
de tiempo antes de la muerte (609 +/- 125 días) tomado de los controles (5
ratas) y Roundup grupos (5 ratas) en comparación con los 10 animales con este
último la muerte tratada (727 +/- 11 días) tuvieron un q-valor
de 0,99. (DOCX
42 kb)
La disposición 3 :. Video del análisis PCA muestra
una clara separación en grupos de tratados (rojo) y el control (verde) ratas en
muestras de hígado. (WMV 1131 kb)
Archivo adicional 4 :. Video del
análisis PCA muestra una clara separación en grupos de tratados (rojo) y el
control (verde) ratas en muestras de riñón. (WMV 1246
kb)
La disposición 5 :. . Perturbaciones racimo
transcripción Común en el hígado y los riñones de las ratas que recibieron 0,1
ppb Roundup en el agua potable ID es el número de identificación de Affymetrix grupo
transcripción, FC indica el cambio veces (grupos de transcripción upregulated
resaltados en rojo; grupos de transcripción downregulated resaltan en verde), P
es el p-valor (a
dos caras t-test) y q la tasa de falso
descubrimiento (calculado por el método de Benjamini-Hochberg). Las diferencias más
significativas (p <0 class="apple-converted-space" corte="" de="" destacan="" en="" generaron="" gris="" los="" se="" span="" valores="" y=""> de p <0 el="" fc="" y=""> 1.1 utilizando
Qlucore ómicas Explorer 3.0. Los
genes con el cambio veces en la expresión> 2 se resaltan en amarillo. (DOCX 180 kb)
La disposición 6 :. Datos de microarrays es
confirmada por análisis de RT-qPCR. Un total de 18 genes fueron seleccionados al azar entre los grupos
de transcripción 1319 cuya expresión es comúnmente hasta downregulated-o en el
hígado y riñones como se muestra por análisis de microarrays, fueron elegidos
para la validación por RT-qPCR. Los
datos del análisis de microarrays se representa en barras grises y que a partir
de la RT-qPCR en barras negras. El
RT-qPCR se realizó mediante un ensayo TaqMan por cuadruplicado y contrastado en
4 genes de referencia (Gapdh, HPRT1, ACTB y Pes1). Dos colas de Student t-test
se realizó comparando el grupo tratado con Roundup a sus respectivos controles
(* p <0 class="apple-converted-space" span=""> p <0 class="apple-converted-space" span="">
p <0 span="" style="background: #C9D7F1;">El patrón general de la RT-qPCR confirmó los resultados del análisis
de microarrays.
(DOCX 38
kb)
Archivo adicional 7 :. Redes de factores de
transcripción asociados con la alteración de la transcripción de los genes
alterados comúnmente en el hígado y los riñones. La lista de los grupos de transcripción comúnmente perturbados en
el hígado y los riñones se utiliza para la generación de redes que utilizan el
algoritmo regulación de la transcripción con la configuración predeterminada
con MetaCore. (TIFF 4891 kb)
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Alianza Sustentable de
Alimentos (EE.UU.), cuyo apoyo se agradece.
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Fuente: http://www.ehjournal.net
