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domingo, 4 de noviembre de 2012

La mordedura de la abeja actúa como anestescico


La picadura de la abeja: 2-heptanona Secretada por las mandíbulas de abeja durante una mordedura Actúa como un anestésico local en insectos y mamíferos

Alexandros Papachristoforou 1 , 2 , 3 , 4 * , Alexia Kagiava 1, 5 , Chrisovalantis Papaefthimiou 1 , Aikaterini Termentzi 6, Nikolas Fokialakis 6 , Alejo-Leandros Skaltsounis 6 , Max Watkins 7 , Gérard Arnold 2 , 3 , George Theophilidis 1

1 Laboratorio de Fisiología Animal de la Facultad de Biología de la Universidad Aristóteles de Tesalónica, Thessaloniki, Grecia, 2 Laboratoire Evolution, genomas, la especiación, CNRS, Gif-sur-Yvette, Francia, 3Université Paris-Sud, Orsay, Francia, 4 Departamento de Ciencias Agrarias, Biotecnología y Ciencias de la Alimentación, la Universidad Tecnológica de Chipre, Limassol, Chipre, 5 El Chipre Instituto de Neurología y Genética de la Neurociencia, Nicosia, Chipre, 6 Departamento de Farmacognosia y Química de Productos Naturales de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Atenas, Atenas, Grecia, 7 Vita (Europe) Limited, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido

Resumen

Las abejas secretan 1 2-heptanona (2-H) de sus glándulas mandibulares cuando pican. Los investigadores han identificado varias funciones posibles: 2-H podría actuar como una feromona de alarma para reclutar guardias y soldados, que podría actuar como un marcador químico, o podría tener alguna otra función. El papel real de 2-H en el comportamiento de las abejas sigue sin resolverse. En este estudio, mostramos que el 2-H actúa como un anestésico en pequeños artrópodos, tales como larva de polilla (WML) y los ácaros Varroa, que se paralizan después de una picadura de abeja. Hemos demostrado que las mandíbulas de abejas puede penetrar en la cutícula de WML, la introducción de menos de un nanolitre de 2-H en el sistema circulatorio abierto WML y causando anaesthetization instantánea que dura unos pocos minutos. La primera indicación de que el 2-H actúa como un anestésico local fue que su efecto sobre la respuesta de las larvas de inhibición, y la recuperación es muy similar a la de la lidocaína. Se compararon los efectos inhibitorios de 2-H y lidocaína en los canales de sodio dependientes de voltaje. Aunque ambos compuestos comandos y los hNav1.6 hNav1.2 canales, lidocaína fue ligeramente más eficaz, 2,82 veces, en hNav.6. En contraste, cuando los dos compuestos se ensayaron utilizando una preparación ex vivo-la rata aislado nervio ciático-la función de los dos compuestos fue tan similar que fueron capaces de clasificar definitivamente 2-H como un anestésico local. Usando el mismo método, se demostró que el 2-H tiene el más rápido efecto inhibidor de todo alquil-cetonas ensayados, incluyendo los isómeros 3 - y 4-heptanona. Esto sugiere que la selección natural puede haber favorecido 2-H a través de otros compuestos similares, debido a las ventajas asociadas a la aptitud que confiere. Nuestros resultados revelan una función previamente desconocida de 2-H en comportamiento de las abejas defensivo y debido a su exposición menor neurotoxicidad potencial para el desarrollo de un nuevo anestésico local a partir de un producto natural, que podría ser utilizado en la medicina humana y veterinaria.

Citación: Papachristoforou A, Kagiava A, Papaefthimiou C, Termentzi A, Fokialakis N, et al. (2012) de la picadura de la abeja: 2-heptanona Secretada de mandíbulas Honeybee durante una mordedura Actúa como un anestésico local en insectos y mamíferos. PLoS ONE 7 (10): e47432. doi: 10.1371/journal.pone.0047432
Editor: MC Efthimios Skoulakis, Alexander Flemming Ciencias Centro de Investigación Biomédica, Grecia
Recibido: 30 de marzo de 2012, Aceptado: 17 de septiembre de 2012, Publicado: 16 de octubre 2012
Copyright: © Papachristoforou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y se acredite la fuente.
Financiación: La investigación fue dirigida y financiada por Vita (Europe) Limited, UK. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: la investigación fue financiada a través de Vita (Europe) Limited, una pequeña empresa británica especializada sólo en la salud de abejas. MW trabaja para esta empresa. Los estudios originales examinado comportamiento de las abejas y descubrieron las propiedades anaesthetisation de 2-H en los mamíferos sistemas nervioso periférico como una extensión del trabajo de biología de abejas. Vita ha solicitado una patente sobre el uso potencial de la 2-heptanona como anestésico local (Patente Internacional Número de solicitud: PCT/GB2012/050157). Esto no altera la adherencia de los autores a todos los PLOS ONE políticas de intercambio de datos y materiales. Todos los demás autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

Introducción



2-heptanona (2-H) es secretada por las glándulas mandibulares de las abejas adultas. La cantidad de 2-H secretada por una abeja individual aumenta progresivamente con la edad, alcanzando niveles máximos en guardias y recolectores [1] - [3] . La hipótesis dominante sobre el papel de 2-H es que actúa como una feromona de alarma que activa las respuestas defensivas y guardias reclutas y soldados en la cara de una amenaza potencial [4] - [7] . 2-H también podría actuar como un marcador químico, la señalización a otros de forraje que una flor ya ha sido visitado [8] , [9] . Sin embargo, los resultados contradictorios de investigación puesto en duda la hipótesis de que el 2-H actúa como una feromona de alarma, que no activaba una respuesta defensiva a las abejas cuando se aplicó experimentalmente a las colonias [2] , [10] y parece ser demasiado volátil para funcionar como un marcador químico en las flores [2] , [11] . También hay un debate sobre si la 2-H secretada por las abejas guardia atrae o repele a otras abejas melíferas, sino que parece ser atractiva en concentraciones bajas y repulsivas en concentraciones más altas [6] , [11] . Teniendo en cuenta todos estos resultados contradictorios, es justo decir que el papel de la 2-H en comportamiento de las abejas (especialmente en el comportamiento defensivo) sigue sin resolverse [11] .
En un intento por aclarar el papel de 2-H, se observó que los intrusos colmena como las larvas de polilla de la cera (WML, Galleria mellonella) y el ácaro parásito Varroa destructor, se paralizaron por un tiempo corto después de ser picado por las abejas. Las abejas utilizan sus mandíbulas para morder a los invasores que son demasiado pequeños para picar [12] , [13] . Esto nos llevó a sospechar que los intrusos pueden haber sido anestesiada por 2-H secretada por las glándulas mandibulares durante morder. El propósito de este documento es proporcionar una investigación a fondo de las posibles propiedades anestésicas del 2-H durante abeja defensa y examinar si 2-H actúa como un anestésico local en los mamíferos sistema nervioso periférico.

Resultados



¿El 2-H Función como una feromona de alarma?

Primero probamos la hipótesis de que las abejas segregan dominante 2-H como una feromona de alarma que recluta a otras abejas melíferas en la cara de una amenaza potencial. Monitoreamos respuesta abeja a diferentes dosis de 2-H aplicados en las entradas de la colonia. En las colonias de control, que no fueron expuestos a 2-H, un promedio de 46,42 abejas dejó la colonia por minuto (n = 5, SEM = 0,43). No hubo diferencia estadística, 10 minutos después de la aplicación, entre el número medio de abejas reclutados en las colonias de control y los reclutados en las colonias expuestas a 0,1 l 2-H (media = 47,18, n = 5, SEM = 0,36, p = 1,000) . En contraste, la dosis más altas de 2-H actuó como un repelente. Comparado con los controles, las abejas significativamente menos salido de la colmena por minuto en las colonias expuestas a 10 l 2-H (media = 42,54, n = 5, SEM = 0,11, p = 0,003) y a 1000 l 2-H (media = 40,88 abejas , n = 5, SEM = 0,42, p = 0,002) ( Fig.. 1 ). Los resultados anteriores muestran claramente que la aplicación de 2-H no reclutar las abejas de la cavidad del nido y no provocaba respuestas defensivas (no ataque a los papeles de filtro que contienen 2-H).
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Figura 1. Número de abejas colmenas después de la salida 2-H aplicaciones
. No existe ningún tratamiento (control) y las dosis de 0,001, 10 y 1000 l de 2-H se aplica a la entrada de la colonia. Las abejas se registraron utilizando contadores electrónicos BeeSCAN.
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.g001

Morfología y secreción Mandíbula 2-H

2-H se secreta de las glándulas en la superficie interior de las mandíbulas de abejas, fluye fuera de un poro (P en la fig. 2a ), y se dirige a través de una ranura 440-470 micras de largo (G) en la espátula (S) en el filo de las mandíbulas. La espátula afilada, asistido por espiga-protuberancias en la espátula (S en la figura. 2a ), puede penetrar en la cutícula suave de WML creando una pequeña herida triangular de alrededor de 0,01 mm 2 ( Fig. 2b ). 2-H entra en la cavidad del intruso cuerpo a través de la herida y luego se diluye en el plasma de la hemolinfa, a través del sistema circulatorio abierto (la solubilidad de 2-H en agua es de 4,3 mg / ml).
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Figura 2. La mandíbula abeja y el resultado de las larvas de polilla de la cera morder
A.) SEM exploración de una mandíbula abeja. P, el poro de la cual 2-H se segrega; G, surco, S, picos,. E, bordes b) la abertura creada en un exoesqueleto de larvas de la polilla de cera después de una picadura de abeja. 1, 2, y 3 son partes de la mandíbula que penetran en los puntos correspondientes en el exoesqueleto cera larvas de la polilla.
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.g002

Efecto de la 2-H sobre larvas de la polilla de cera

WML exhiben un patrón constante de locomoción que puede ser fácilmente grabado durante un período prolongado por suavemente sujetando la cabeza a un sustrato de cera y la fijación de la cola a la sonda de un transductor de fuerza isométrica desplazamiento [14] (control, fig. 3a ). El patrón de locomoción de la WML pequeño, atado (0.001-0.002 g de peso corporal) para inmediatamente después de una picadura de abeja, pero luego se recuperó gradualmente en unos pocos minutos (media = 7,32 min, n = 6, SEM = ± 1,51) ( Fig. 3a ). El patrón de locomoción no se vio afectada cuando se simula una picadura de abeja mediante la aplicación de presión mecánica a la región dorsal de WML usando un par de pinzas finas simulando la presión causada por la mordedura.
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Figura 3. El patrón de locomoción de larvas de polilla de la cera tethered y el reflejo de la gravedad de los ácaros Varroa
. A) Respuesta de pequeño tamaño de las larvas de polilla de la cera (WML) mordido por una respuesta de abeja, b) de gran tamaño WML inyectados con 2,5 l de 2-H, c) respuesta de gran tamaño WML inyectados con 1,63 mg de lidocaína d, e) lamodificación del reflejo de la gravedad de Varroaexpuesto a 0,025 y 0,061 l l de 2-H (respectivamente), barra de escala vertical: un 3,4 mN, b 9,8 mN, c 75 μΝ, d 9,8 mN.
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.g003
Para identificar si era, de hecho, 2-H que la parálisis inducida en WML, se realizaron análisis cuantitativos y cualitativos de la guardia de abejas glándulas mandibulares mediante GC-MS y encontró que cada abeja tiene un promedio de 0,0386 l de 2-H (n = 30, SEM = ± 0,0076). Además, se detectó un promedio de 0,00065 l de 2-H (n = 30, SEM = ± 0,00018) en todo mordido, paralizado de pequeño tamaño WML (32,6 g / 1 g de peso corporal). No se detectaron 2-H en no mordido WML, control (n = 10) o en totalmente recuperado WML (n = 10).
Cuando más grande WML (0,25 g de peso corporal) fueron inyectados con una dosis extraordinariamente alta de 2-H (2,5 l), usando una microjeringa (8,15 mg por 1 g de peso corporal), el movimiento del cuerpo se detuvo bruscamente ( Fig. 3b ) y la recuperación fue muy lenta recuperación mucho más lenta que la observada cuando WML fue mordido por una abeja melífera (87,62 min, n = 8, SEM = ± 7,21). Esto sugiere que el efecto paralizante era dependiente de la dosis.La inyección de un volumen equivalente de agua destilada o solución salina fisiológica no tuvo ningún efecto significativo en el patrón de locomoción de la WML, lo que indica que el efecto paralizante se debió a 2-H sólo.

Efecto de la 2-H en Varroa Destructor

Probamos 2-H en un artrópodo mucho más pequeño que parasita a las abejas, el ácaro Varroa destructor. Cuando 0,025 l de 2-H se aplicó tópicamente en el esternón de los ácaros (n = 10) fijo lado ventral hacia arriba, la gravedad de reflejo de la expansión rítmica del tórax y abdomen [15] -estaba distorsionado ( Fig. 3d ). Cuando la concentración se incrementó a 0,061 l, el reflejo gravitacional completamente mal funcionamiento y los ácaros Varroa (n = 10) se paralizaron totalmente dentro de 30-40 s ( Fig. 3e ) sin recuperación, incluso después de 12 h de observación. Se aplicaron concentraciones mayores de 2-H a los ácaros Varroa tópicamente porque el tamaño de los ácaros pequeño hizo imposible inyectar 2-H en la hemolinfa.

Comparación de los efectos del 2-H y lidocaína sobre las larvas de la polilla de la cera

El patrón de 2-H acción sobre el sistema nervioso WML-inhibición de la locomoción y la recuperación (bloqueo reversible de la excitabilidad)-parece imitar la pauta de acción de anestésicos locales (LAS).Para probar si la lidocaína, un estándar LA [16] , tiene el mismo patrón de acción en WML como 2-H, se inyectó 1,63 mg de lidocaína (correspondiente a 2,5 l 2-H) en WML grande; esta dosis tenían un efecto letal en los 12 casos. Sin embargo, una dosis media (0,81 mg) produjo un bloqueo reversible del patrón de locomoción ( Fig.. 3c ) con recuperación total después de 6,42 h (n = 5, SEM = ± 0,84).Estos datos indican que la 2-H y lidocaína podrían compartir un patrón similar de acción-un bloqueo reversible de la locomoción de WML-lo que sugiere que 2-H también actúa como un LA y pueden compartir un objetivo común con lidocaína. La lidocaína bloquea los canales de sodio dependientes de voltaje (VGNaCs) de ambos insectos [16] y los mamíferos [17] .

En comparación in vitro de Acción de 2-H y lidocaína en células de mamífero

Para probar si el 2-H también puede actuar bloqueando VGNaCs, hemos utilizado la PatchXpress 7000A para exponer mamíferos CHO (ovario de hámster chino) transfectadas con hNav1.2 y hNav1.6 canales a diversas concentraciones de ambos 2-H y lidocaína. Para 2-H, la corriente de entrada generado por la despolarización de las células se registra dentro de los 3 primeros minutos de exposición a eliminar los problemas creados por la alta volatilidad (véase Materiales y Métodos ) se trazan las curvas de concentración-respuesta para la 2-H frente hNav1.2 y hNav1.6 canales bajo tónico y condiciones fásicas ( Fig. 4 a, b, c, d) y calcula los valores de CI 50 (concentración requerida para inhibir la función de 50% de la corriente de sodio normal) ( Tabla 1 ). También, fue posible estimar los valores de CI 50 de la lidocaína a partir de curvas similares, en contra de los mismos canales iónicos ( Tabla 1 ). Los resultados mostrados en la Tabla 1 indican una discrepancia entre el efecto anestésico local de 2-H y la de la lidocaína en los experimentos fásicos. En los experimentos fásicas, 2-H era 7,5 veces menos activo que la lidocaína para hNav1.2 y hNav1.6. En contraste, en los experimentos tónicas, 2-H era 3,97 veces menos activa que la lidocaína para hNav1.2 y sólo 2,82 veces menos activos para hNav1.6-un canal situado en la región nodal de las fibras nerviosas [18] .
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Tabla 1. IC 50 de 2-H y lidocaína aplicada a hNav1.2 hNav1.6 y canales iónicos.
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.t001
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Figura 4. El efecto de la 2-heptanona en hNav1.2 (a) y hNav1.6 (b) canales de sodio
. Los datos representan tónico (A y C) y efectos fásicas (B y D). Las curvas continuas representan cuando los datos están equipados con una ecuación logística con efectos mínimos y máximos fijados en 0 y el 100% (n = 6).
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.g004

Ex Comparación in vivo de la acción del 2-H y lidocaína en una fibra nerviosa mamíferos

Debido a que los experimentos in vitro indican que la 2-H era 2,82 veces menos eficaz que la lidocaína para hNav1.6 canales, se utilizó una preparación ex vivo-las fibras nerviosas ciático de rata aislados en un baño de grabación de tres cámaras ( Fig. 5. b) - para comparar la acción anestésica local de 2-H y lidocaína. El compuesto del potencial de acción del nervio (NCAP, la fig. 5a ) se utilizó como un índice de viabilidad de las fibras nerviosas en el baño de grabación. La ventaja de la cámara de registro es que la amplitud NCAP se mantuvo constante durante más de 24 h para los nervios incubados en solución salina y estimulado continuamente usando normal (1 Hz) estimulación supramáxima.Después de 24 h de estimulación continua, la amplitud de la NCAP comenzó a disminuir gradualmente debido a la natural de fibra nerviosa inactivación [19] . Cuando las fibras nerviosas se incubaron en solución salina con 3,41 mg / ml de 2-H, hubo una drástica disminución en la amplitud de la NCAP ( Fig. 5 , primera flecha), y la NCAP se eliminó completamente dentro de 220 ​​a 230 s, que indica que todas las fibras del nervio ciático fueron inactivados. En este caso, las cámaras con la solución salina (los nervios y los electrodos de registro) se cerraron herméticamente, mediante una tapa ( Fig. 5 b), para evitar la evaporación de 2-H. En esta etapa, los nervios se recuperó rápidamente una vez que las fibras del nervio ciático se lavaron y la mezcla 2-H/saline se reemplazó con solución salina normal (Fig. 5 una flecha, segundos).
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Figura 5. La evocado NCAP desde el nervio ciático de rata aislado expuesto a la solución salina y 2-H
. A) La amplitud de la NCAP, línea de base hasta el pico, se utiliza como el parámetro principal para cuantificar la vitalidad de las fibras del nervio ciático durante la exposición a 2-H. El registro presenta la disminución de la amplitud NCAP durante la exposición del nervio ciático a 3,41 mg / ml de 2-H.La primera flecha indica el inicio de la aplicación y la segunda flecha indica el tiempo cuando el nervio se lavó y se bañaron en solución salina normal. Durante la exposición a 2-H, los registros se realizaron a una tasa de 1 por 20 NCAP. Después de 2-H se reemplazó con solución salina normal, las mediciones fueron tomadas cada 15 min. Barra de escala vertical: 3 mV. Barra de escala horizontal:. 6 ms b). Representación esquemática de la bañera grabación de tres cámaras de plexiglás.Se compone de la grabación (R), la perfusión (P) y las cámaras de estimulantes (S), separadas por dos tabiques. El nervio ciático se coloca a lo largo de las tres cámaras que se llenaron con solución salina oxigenada para cubrir el nervio. Las dimensiones de cada cámara estaban 26 × 26 × 10 mm (anchura length., profundidad), volumen total de 10 ml. La cubierta (c) de plexiglás se utiliza para cerrar herméticamente el sistema de grabación completa, mientras que el aire en el interior del baño se saturó con 2-H, para eliminar la evaporación de 2-H en la cámara de perfusión.
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.g005
Uso de la amplitud de la NCAP, medida desde la línea base hasta el pico, que trazan las curvas de respuesta de tiempo-(curvas de vitalidad) de los nervios ciático expuestos a 3,41 mg / ml de 2-H y lidocaína en condiciones normales de estimulantes ( Fig. 6a ). También trazó las curvas de respuesta de tiempo para tres concentraciones de otros (10,0, 2,28 y 1,41 mg / ml) y los utilizaron para estimar el tiempo requerido para la inhibición del 100% de la NCAP (llamado IT 0) y el tiempo que se requiere para inhibir la amplitud de la NCAP a 50% de su valor de control (llamado IT 50) ( Tabla 2 ). Uso de las TI 0 valores que se muestran en la Tabla 2 para 2-H y lidocaína, que trazan las curvas de concentración-respuesta. Por lo tanto, el IC 50 se estimó en 0,469 (SEM ± 0,002) para el 2-H y 0,337 mg / ml de lidocaína (SEM ± 0,001).
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Figura 6. El efecto de la 2-H, lidocaína y otros alquil-cetonas en el nervio ciático de la rata
A.) Los efectos de la 2-H y lidocaína (Lido) en el NCAP del nervio ciático de la rata, las curvas de respuesta de tiempo de 3,41 mg / ml de 2-H y lidocaína. B) las curvas de respuesta de tiempo después de la preparación fue se lavó con solución salina normal (recuperación) y el NCAP se controló durante 24 h, c) las curvas de respuesta de tiempo de 3,41 mg / ml de 2-H, 3H, 4H, d) la recuperacióne) 2-pentanona (2-Pe) , 3-pentanona (2-Pe), 2-hexanona (2-He), 2-octanona (2-Oc) y 3-octanona (3-Oc) f) las curvas de respuesta de tiempo después de que las preparaciones se lavaron con normalidad solución salina (recuperación) y el NCAP se monitorizó durante 24 h.
doi: 10.1371/journal.pone.0047432.g006
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Tabla 2. Los efectos de la 2-heptanona y lidocaína en el nervio ciático aislado de la rata.
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Además, los efectos de la 2-H y lidocaína en el nervio ciático fueron reversibles. Las mediciones mostraron que NCAP amplitud recuperada a 89,51% (n = 8, SEM ± 5,87) para 2-H y 95,5% (n = 8, 4,06 ± SEM) para la lidocaína cuando se lavan con solución salina normal, y se mantuvo a este nivel durante menos al menos 24 h-una indicación de que ningún compuesto tiene un efecto significativo (p> 0,05) en la vitalidad de las fibras del nervio ciático ( Fig. 6b ).

Comparación de la acción de 2-H y compuestos similares en una fibra nerviosa mamíferos

También trazó las curvas de respuesta de tiempo de 3,41 mg / ml de los isómeros heptanona, 3-heptanona (3-H) y 4-heptanona (4-H) ( Fig. 6 c y d), así como de otros alquilo -cetonas ( Fig. 6e y f ).Aunque la IT 50 para 2-H no fue significativamente diferente de 3-H y 4 H-( Tabla 3 ), 2-H es más activas en general-la IT 0 para 2-H fue significativamente menor (p <0 3-h="3-h" 4-h="4-h" a="a" de="de" href="http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=es&rurl=translate.google.com.uy&sl=en&tl=es&twu=1&u=http://www.plosone.org/article/info%253Adoi%252F10.1371%252Fjournal.pone.0047432&usg=ALkJrhiph9u0t0Tr-SErTYzovJs54GRLGQ#pone-0047432-t003" la="la" nbsp="nbsp" que="que" style="color: #004466;" y="y">Tabla 3
 ). 2-H tenía el más rápido efecto inhibidor sobre la NCAP de todas las cetonas restante examinado.El IT 50 para 2-H fue significativamente diferente de la de 2-hexanona, 2-octanona, 3-octanona, 2-pentanona y 3-pentanona ( Tabla 3 ). Además, el IT 0 para 2-H fue significativamente menor (221,88 s) que en toda otra de las cetonas (400 a 765 s para todos pero 2-pentanona, que era mayor que 24 h; Tabla 3 ).
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Tabla 3. Comparación de las propiedades de anestésico local de la 2-heptanona con las cetonas otro.
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2-H, los otros heptanones (3-H y 4 H-), y el resto de las cetonas de alquilo que hemos examinado bloqueados reversiblemente la excitabilidad del nervio ciático de la rata. Recuperación de la NCAP, después de la solución salina + compuesto se retiró y se reemplazó con solución salina normal, se controló durante 24 h, y fue casi idéntica para todos los compuestos-80 a 95% del control ( Fig. 6 b, d y f).

Discusión



Se utilizaron pruebas de campo para investigar la hipótesis dominante actual que el 2-H, secretada por las glándulas de las abejas melíferas mandíbulas, funciona como una feromona de alarma que estimula reacciones defensivas de comportamiento contra una amenaza potencial. Los resultados registrados por los contadores electrónicos en la entrada de la colmena no mostró claramente reclutamiento de abejas defensivas de la cavidad del nido, apoyando los resultados previos obtenidos utilizando diferentes métodos [2] , [10] . Guardia comportamiento de las abejas era normal a bajas dosis de 2-H y observamos ninguna otras respuestas defensivas, como el comportamiento de picadura. Si 2-H estaban actuando como una feromona de alarma, las respuestas deben ser instantánea-electroantenogram grabaciones han demostrado que las abejas pueden detectar fácilmente la presencia de 2-H [20] . Aunque 2-H es muy volátil y fácilmente detectable por las abejas en concentraciones bajas (4,049 mg / mL; fracción molar = 6,19), la ausencia de cualquier reacción durante nuestra investigación o durante los experimentos en 2-H fue entregado a la entrada de la colmena a través del aire bombeo [10] sugiere que es poco probable que el 2-H funciones en feromonal "emisión-recepción" transmisión de una abeja guardia a la colonia.
El presente estudio reveló que, además de inyectar veneno a través de una picadura, las abejas pueden utilizar 2-H para la defensa, para paralizar a los invasores que son demasiado pequeños para picar. 2-H se produce en las glándulas mandibulares, publicado por el poro de la mandíbula de un depósito y a través de los flujos de ranura en el borde afilado de las mandíbulas. Creemos que, con base en nuestros estudios morfológicos y de la evidencia anatómica proporcionada por otros [21] , que la liberación de 2-H no es pasiva, sino activa controlada por la contracción de los músculos mandibulares. Las abejas utilizan continuamente sus mandíbulas para muchas tareas durante su ciclo de vida, y evidentemente no es práctico para liberar 2-H con cada bocado. Suponemos que el 2-H se libera sólo durante una mordedura defensiva fuerte, desde el depósito de 2-H está estrechamente asociado con otros músculos mandibulares y está muy cerca de la apodema del músculo aductor, corriendo a lo largo del depósito en una posición paralela [ 21] . Por lo tanto, la contracción potente de estos músculos durante una mordedura defensiva fuerte puede ejercer presión sobre el depósito, la liberación de 2-H fuera del poro hasta el borde de la espátula agudo. Hemos demostrado que durante una mordida, la espátula penetra la cutícula de un parásito, tal como WML, para inyectar 2-H en el plasma de la hemolinfa. El sistema circulatorio abierto del parásito permite la perfusión instante de 2-H a casi todas las partes del cuerpo. Nuestros resultados han demostrado que 0,00065 l / WML de 2-H es suficiente para paralizar a los invasores, pero sólo por unos pocos minutos, tiempo suficiente para que puedan ser retirados de la colmena. Esta táctica defensiva de inyección de "veneno" a través de las mandíbulas durante una fuerte mordida parece paralela a la de otras especies, como las serpientes, que inyectan veneno a través de sus dientes durante una fuerte (a la defensiva es decir) mordedura.
La rápida recuperación de la WML que fueron inyectados con 2-H, combinado con el hecho de que el 2-H no se ha encontrado en las muestras recuperadas durante nuestra GC-MS estudios, indican que este compuesto se metaboliza rápidamente, posiblemente a través del sistema del citocromo P450 insecto [22] . Aunque no hay datos para el metabolismo de la 2-H en los insectos, en ratas macho Fischer 344, 2-H es metabolizado a CO 2, acetato y una variedad de compuestos que podrían ser o bien anabólica o catabólica o una combinación de los dos [ 23] . Aunque es todavía una hipótesis, WML recuperación después de la inyección con lidocaína sugirió que WML tienen el potencial para metabolizar este LA, probablemente por insectos del citocromo P450. La lidocaína es metabolizada por los microsomas hepáticos humanos y humanas purificadas del citocromo P450 a monoetilglicinexilidida (MEGX) y 3 hydroxylidocaine-(3-OH-LID) [24] .
El patrón de 2-H acción en WML es un rápido, una inhibición dosis dependiente de patrón de locomoción seguido por una rápida recuperación. En los invertebrados y los vertebrados, la locomoción se produce generalmente por un generador central de patrones (CPG)-una red neural que consiste en interneuronas y motoneuronas que interactúan a través de las terminales sinápticas.Además, el CPG es impulsado por las neuronas sensoriales y sus axones, mientras que lo conduce a través de los músculos motor axones y las uniones neuromusculares [25] . La parálisis instantánea de WML causado por 2-H y la recuperación rápida indica que esta cadena de control neuronal fue interrumpido en uno o más puntos, pero sólo para unos pocos minutos. En el caso de otro invertebrado, el ácaro Varroa destructor, esta interrupción camino es irreversible y lleva a la muerte, probablemente debido al pequeño tamaño de este ectoparásito. Las abejas utilizan el llamado "grooming" comportamiento para eliminar los ácaros de los cuerpos de sus compañeros de nido, que utilizan sus mandíbulas para morder y quitar Varroa [13] , [26] , [27] . Las colonias en las que un gran número de ácaros muertos y dañadas se acumulan en el tablero inferior colmena están correlacionados con el comportamiento higiénico efectiva a través de la preparación. Es posible que esta capacidad se ve facilitada por rápido y eficaz de picadura de ácaros, depositando 2-H en la cutícula de la Varroa, que a su vez provoca la parálisis y la muerte.
Inhibición rápida de la actividad neural seguido por una recuperación rápida es un típico efecto de los anestésicos locales. El hecho de que la lidocaína, la norma anestésico local, se encontró que tienen un patrón similar a la de 2-H en WML en nuestro experimento, combinado con el hecho de que la lidocaína actúa sobre VGNaCs insectos y de mamíferos [16] , fue el primer indicio de que 2-H puede actuar como anestésico local en el sistema nervioso de WML. Este hallazgo nos llevó a comparar la acción del 2-H con la de la lidocaína.
Hemos probado y comparado los efectos de 2-H y lidocaína in vitro en hNav1.2 y hNav1.6 canales y ex vivo en las fibras del nervio ciático de la rata in vitro, los estudios de patch-clamp mostró una discrepancia;. En los experimentos fásicas 2 -H fue 7,5 veces menos eficaz que la lidocaína. Sin embargo, en las pruebas tónico sobre hNav1.6, 2H era 2,82 veces menos eficaz que la lidocaína. Esta similitud entre 2-H y lidocaína, también puede indicar una acción anestésica local de 2-H, ya que el canal hNav1.6 se encuentra en la zona nodal de las fibras nerviosas periféricas [18] y es obviamente involucrados en la inhibición de la acción potencial causado por los anestésicos locales [28] .
En los estudios ex vivo, 3,41 mg / ml de lidocaína eliminó el NCAP en 147,55 s, mientras que la misma concentración de 2-H tomó 221,88 s-un retraso de sólo 70-75 s, un período relativamente corto, dado que la anestesia local puede durar durante 2 h. No hubo diferencia significativa en la recuperación después de la exposición a 2-H o lidocaína (89,5 y 95,5% se recuperan en el mismo tiempo: 30-45 min). Además, el IC 50 fue de 1,4 veces mayor para 2-H que la lidocaína (2-H fue de 1,4 veces menos eficaz). Así, la comparación de los dos compuestos utilizando el nervio ciático aislado preparación-utilizado ampliamente para evaluar propiedades anestésicas locales de otros compuestos [29] - [34] , ha demostrado que el 2-H y lidocaína tienen una acción similar, más el apoyo de la clasificación 2-H como un compuesto con propiedades anestésicas locales.
Los resultados de los experimentos in vitro y ex vivo eran bastante similares (IC 50 de 2-H 2,8 frente a1,4 veces mayor que la lidocaína), a pesar del hecho de que las pruebas de patch-clamp aplica sólo a un único canal de iones, mientras que los experimentos en la fibra nerviosa aplica a todos los canales de iones implicados en la generación del potencial de acción. Aunque existe una diferencia, es importante tener en cuenta que la interpretación de los experimentos sobre las fibras nerviosas enteros, donde el potencial de acción es una interacción entre la activación de muchos canales de navegación, es más compleja. Por ejemplo, el canal Nav1.6 se expresa solo o junto con Nav1.1 en los nodos de Ranvier [18] mientras que Nav1.8 y Nav1.7 se expresa en las neuronas sensitivas [28] de las fibras del nervio ciático. Además, es posible que exista una diferencia de las especies (hámster-rata) entre la in vitro y los métodos ex vivo hay una diferencia de las especies que muy bien podrían explicar las diferencias observadas; diferencias de las especies se han encontrado para otros compuestos que afectan VGNaCs [35] . Por lo tanto, creemos que los resultados obtenidos utilizando la preparación nervio ciático entero, que indican una acción anestésica local de 2-H, podría ser igualmente fiables a los del experimento de iones de un solo canal. Por lo tanto, 2-H, con un IC sólo 1,4 veces mayor que la de la lidocaína 50, también puede ser clasificado como un anestésico local.
En este punto, cabe mencionar que el 2-H tenía el más rápido efecto inhibidor en comparación con el 3-H y H-4, con una IT 0 de 221S. Heptanones se encuentran generalmente a ser mucho más eficaz que todos los otros alquil-cetonas examinado, tal como 2,3-pentanones, 2 hexanona, y 2,3-octanonas. El hecho de que el 2-H tiene la respuesta más rápida de todos los demás alquil-cetonas pueden responder a la pregunta: "¿Por qué las abejas inyectar 2-H y no otra cetona?" Suponemos que la selección natural favoreció 2-H debido al estado físico asociado confiere ventajas sobre otros compuestos similares, (más rápido efecto inhibidor sobre el sistema nervioso). Además, parece que el 2-H fue también "seleccionado" por otras razones, ya que una de sus principales ventajas es que su IC 50, evaluado tanto in vitro y ex vivo, es muy inferior a su solubilidad en agua. Un ejemplo convincente es el hecho de que 3,41 mg / ml eliminó el NCAP del nervio ciático dentro de 221 s, mientras que una concentración de 10 mg / ml, aproximadamente tres veces superior, elimina la NCAP en sólo ligeramente menos tiempo-195 s.
Venenos de animales a menudo se utilizan para crear una gama de medicamentos [36] , [37] ; este estudio se encontró que la 2-H tiene una acción equivalente a la lidocaína cuando se examina usando la preparación de todo el nervio. La cuestión aquí es si el 2-H puede pasar las pruebas preclínicas y clínicas requeridas con el fin de ser considerado un LA que se puede utilizar en la práctica clínica. No hay evidencia a favor de explorar 2-H como LA nueva. La vigilancia de 24 horas de vitalidad nerviosa mostraron ninguna acción neurotóxica de 2-H o lidocaína dentro de los límites de tiempo del métodoex vivo particular. También, 2-H se ha encontrado que no tienen efectos neurotóxicos cuando se prueba in vivo sobre los nervios de la cola de rata [38] , mientras que la lidocaína se ha asociado con algunos efectos neurotóxicos [32] , [39] - [41] . Por ejemplo, se ha demostrado que 80 mM de lidocaína perturba la membrana axonal del nervio ciático de la rata in vitro [32] . Dado que la lidocaína se utiliza ampliamente en la práctica clínica, a concentraciones de 2% (o 20 mg / ml 80 mM), no hay una motivación para desarrollar nuevos anestésicos locales y, posiblemente, menos tóxicos. 2-H podría ser un buen candidato ya que a) se trata de un producto natural (venenos de caracol cono se han utilizado ya como analgésicos [42] ), b) presenta excelentes propiedades anestésicas locales, lo que equivale a la lidocaína, c) tiene una lipofilia cerca de la de la lidocaína (logP de 2-H es 1,98 y para la lidocaína es 2,26), d) tiene una efectividad máxima por debajo de su solubilidad en agua, e) que se metaboliza durante el mismo período de tiempo como la lidocaína, al menos en los invertebrados.Además, 2-H es generalmente menos tóxicos, con una aguda LD 50 de 1670 mg / kg (oral, rata) en comparación con 313 mg / kg de lidocaína. La FDA ha evaluado el perfil de seguridad de 2-H y describe la sustancia como un "aditivo alimentario autorizado por adición directa a los alimentos para el consumo humano" (21 CFR 172.515). El descubrimiento de un nuevo anestésico local derivado de las abejas abre nuevas oportunidades tanto para la investigación de comportamiento de las abejas defensivo y para la investigación farmacéutica en el desarrollo de un nuevo y potencialmente menos tóxico, de anestesia local.

Materiales y Métodos



Declaración de Ética

Las muestras de las abejas y las larvas de polilla de la cera se obtuvieron de colmenar A. Papachristoforou privado o con la autorización de los colmenares privado de Argiris Grigoriou (ciudad de Larnaca), ubicada en la República de Chipre. No hay permisos específicos se requiere para los estudios de campo se describe la participación de las colonias de abejas (), ya que se llevaron a cabo en colmenar privado AP. Todos los procedimientos experimentales en la rata cumplido con los protocolos descritos por el comité de ética de la Universidad Aristóteles de Tesalónica, Grecia, en relación con las prácticas recomendadas estándar para Investigaciones Biológicas (Número de licencia: 30,497). Además, los experimentos fueron aprobados por las autoridades veterinarias locales (Ministerio de Desarrollo Agropecuario y Alimentación, Salónica 09/06/2011, número de protocolo 144256/864).

Seguimiento de la Contratación de abejas defensivas con contadores BEESCAN

Hemos llevado a cabo experimentos de campo en el colmenar, en la que se utilizó dispositivos electrónicos de seguimiento [43] (BeeSCAN v2.03) para comprobar si la presencia de 2-H en los tablones de colonias vuelo estimulado la contratación de las abejas defensivas. Los dispositivos de monitorización contó el número de abejas que salen de la colmena una vez por minuto durante 10 minutos para cada una de las cinco colonias por tratamiento. Un aumento en el número de abejas que salen de la colonia comparación con los controles indica que más abejas son reclutados para el vuelo a bordo de participar en la defensa. Una disminución en el número de abejas que salen de la colonia comparación con los controles indica que las abejas están siendo repelidos de las juntas de vuelo. Para aplicar 2-H, se siguió la metodología estándar descrita en los experimentos anteriores [2].

Grabación del patrón de locomoción de larvas de polilla

Para controlar el patrón constante de locomoción de WML, la sonda de un transductor de desplazamiento de fuerza (FT-03C, Compañía Grass Instrument, EE.UU.), unido a un micromanipulador, se engancha a la cola de la WML, mientras que la cabeza fue fijado cuidadosamente a un sustrato de cera [44] , [14] . La señal eléctrica generada por la fuerza rítmica producido durante la locomoción se amplificó y se alimenta a un ordenador a través de una interfaz de tarjeta de adquisición de datos (Keithley KPCI 3102, Keithley Instruments, Cleveland, OH, EE.UU.).Software diseñado utilizando las instalaciones de LabVIEW (LabVIEW 5.1, National Instruments EE.UU.) permite el análisis de los datos registrados.

Patch-clamp Pruebas

Para probar si el 2-H puede actuar bloqueando VGNaCs, la PatchXpress 7000A fue utilizado.Mamíferos CHO (ovario de hámster chino) transfectadas con ion hNav1.2 y canales hNav1.6 ADNc (SCN2A y genes SCN8A) fueron expuestos a 2-H en ambas condiciones tónicas y fásica. El mamífero CHO-K1 línea de células epiteliales embrionarias (número ATCC CCL-61) a partir de Cricetulus griseusse obtuvo de la ATCC, Manassas, VA. Células CHO-K1 fueron transfectadas con el canal ya sea hNav1.2 o hNav1.6 cDNA (SCN2A y genes SCN8A, respectivamente) y fueron expuestos a 2-H bajo condiciones tanto tónica y fásica.
Los efectos de 2-H se evaluaron en hNav1.2 a 0,73, 1,46, 2,19, y 2,92 mg / ml y en hNav1.6 canales a 0,1, 0,36, 0,73, y 1,46 mg / ml, con cada concentración ensayada en al menos seis células (n = 6). Las células fueron expuestas a cada concentración de 2-H y las mediciones de la corriente hacia el interior se obtuvieron dentro de los 3 primeros minutos de exposición. Esto fue necesario debido a la alta volatilidad de 2-H. Los registros mostraban que hNav1.2 y hNav1.6 canales gradualmente recuperados del efecto inhibidor de la 2-H después de 4-6 minutos de exposición, debido a la 2-H que se evapora de la solución salina. Desde el PatchXpress tiene cámaras abiertas celulares donde las pruebas se produce, no hay manera de sellar herméticamente el experimento.
Por comparación, la acción de la lidocaína también fue probado en hNav1.2 y hNav1.6 canales a concentraciones de 0,0270, 0,2030, 0,4060 y 1,0832 mg / ml. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Los efectos de 2-H y la lidocaína sobre la tónica y fásica bloque de corriente de sodio se cuantificaron mediante el ajuste de curvas concentración-respuesta no lineales utilizando técnicas de regresión (Hill efectos ecuación, mínimo y máximo fijado en 0 y 100 [n = 6] ). Sobre la base de este análisis, se estimó el IC 50.

GC-MS El análisis

Procedimiento de extracción.
Se midió el contenido de 2-H de los siguientes tipos de muestras: a) aislado abeja glándulas mandibular (n = 30), b) las larvas de polilla de la cera (WML, el peso corporal de alrededor de 0,01 g), que había sido picado por las abejas (n = 30)-2-H extraído inmediatamente después de la parálisis c) WML que había sido picado por las abejas (n = 10)-2H-extraído después de una recuperación total, d) no mordidas WML (controles, n = 10).
Para optimizar la detección de 2-H, todas las muestras fueron: 1) tratado con nitrógeno líquido con el fin de detener cualquier proceso enzimático y asegurar la lisis completa de las paredes celulares y, a continuación 2) se extrajo con etanol. Los extractos se centrifugaron, se filtró, y se almacenó a -20 ° C hasta su análisis.
Todas las abejas utilizadas en este estudio fueron los guardias de Apis mellifera cypria, Apis mellifera ligustica y colonias de Apis mellifera Macedónica. Se determinó que las abejas eran guardias través de la observación visual en los accesos de colonias, abejas guardianas fueron definidos como aquellos que se han observado patrullando la entrada y la inspección de las abejas entrantes. Cuando las abejas tenían que morder, se utilizaron fórceps para colocarlos en las proximidades de las larvas de la polilla de la cera en movimiento y luego se aplica una ligera presión en sus thoraxes para inducirlos a morder.
GC-MS.
Los análisis cromatográficos se llevaron a cabo en un Hewlett Packard modelo 6890 de cromatografía de gases con guión a un detector de masas Hewlett Packard 5973 selectiva utilizando impacto electrónico (70 eV) como la fuente de ionización, equipado además con un automuestreador Agilent 6890. Un 5MS HP (30 m x 0,25 mm, grosor de película de 0,25 micras) la columna se utilizó para las separaciones. Se utilizó helio como gas portador (flujo de 0,8 ml / min). La temperatura del horno se programó desde 40 hasta 60 ° C a una velocidad de programación de 2 ° C -1 min y entonces levantado por 10 ° C min -1 incrementos de 60 a 280 ° C (8 min de espera). Las temperaturas del inyector y la línea de transferencia se fijaron en 220 ° C y 280 ° C, respectivamente.Las muestras se inyectaron directamente con un volumen de muestreo de 2 l; los análisis se realizaron en el modo de división (1:5). 2-H fue identificado por comparación de su tiempo de retención (Rt) y espectros de masas con los de muestras auténticas (Sigma-Aldrich), así como desde el partido espectros Wiley biblioteca. Así, bajo las condiciones cromatográficas anteriores, el RT de 2-H era 8,47 min y los iones controlados en EI (70 eV, análisis completo) fueron m / z 43, 58, 71, 85, 99 y 114. Cuantificación, sin embargo, se llevó a cabo en seguimiento de iones seleccionados (SIM) y los iones se monitorizaron a m / z 58 y 71.
Curva de calibración.
Para generar la curva de calibración, se preparan 12 diluciones de 2-H (obtenidos de Sigma-Aldrich) con concentraciones que oscilan entre 0,0001 y 0,075 l / ml. La curva de calibración se obtuvo mediante el trazado de las áreas de los picos contra las concentraciones de analito. Un algoritmo de gradiente generalizada reducida se aplicó usando Excel Solver 2003 con el fin de identificar la curva de calibración lineal apropiado. La curva de calibración usada elimina la suma de la desviación total de 2-H concentraciones sometidas a restricciones específicas que no permiten a cualquier concentración superior a más de 15% de los valores experimentales iniciales. La solución proporciona la siguiente ecuación: Y = 10665,94 * X * 10 4 12035.43, donde Y es el área del pico que se deriva a partir del cromatograma y X es la concentración de 2-H. A continuación, realizó nuevos análisis de sensibilidad, en el que los límites informe indicó que el rango de las dos coeficientes fueron(10665.94, 10686.50) y (12035.43, 12675.95), respectivamente. Estos valores no violó ninguna de las restricciones predefinidas.
Se evaluó la selectividad del método mediante la inyección de seis extractos de control, preparado usando el procedimiento de extracción descrito. En el límite de cuantificación (LOQ), no se observó ninguna interferencia en el tiempo de retención correspondiente al 2-H, lo que demuestra que la metodología tiene una especificidad adecuada.
La exactitud del método (error relativo medio [% parcialidad] entre las concentraciones nominales y medidos) era adecuado, y estaba dentro de ± 15% para cada nivel de concentración.
Cinco niveles de concentración (3 muestras para cada uno), 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,01, y 0,075 l / ml de 2-H, se usaron para estimar intra-e inter-día precisión-medida como la desviación estándar relativa (RSD) de replicar ensayo y precisión-medida como RE error relativo ([concentración nominal medido concentración] / concentración nominal) x100. Para los cálculos inter-día, las muestras se inyectaron en 5 días diferentes. Las RSD fueron inferiores al 10% para ambas mediciones de precisión intra-e inter-día. El ER varió entre -15% y el 9% para ambos precisión intra-e inter-día. Todos exactitud y precisión de datos se presentan en la Tabla S1 .
La sensibilidad del método se evaluó usando los valores de límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ). LOD determina la cantidad más baja de 2-H que se puede detectar utilizando este procedimiento y se calculó como las concentraciones más bajas probadas que producir una relación de señal-a-ruido (S / N) de al menos 3. LOQ refleja la concentración más baja del compuesto que se puede medir y se refiere a una relación señal-ruido de 10. Para este propósito, diez muestras diferentes de etanol en blanco fueron inyectados. LOD se estimó en 5 × 10 -7 y LC en el 5 × 10 -6 l / ml de 2-H.

El ex vivo de rata nervio ciático

Los estudios ex vivo utilizado tanto en ratas macho y hembra que pesan entre 230 y 250 g. Los animales fueron sacrificados con luz anestesia con CO2 y dislocación cervical. El nervio ciático de la rata, que consta de 27.000 fibras del nervio ciático [45] , se aisló en un baño de grabación de tres cámaras ( la fig. 5b ). Los nervios ciáticos fueron disecados de la médula espinal hasta la rodilla, inmerso en oxigenada (O 2, 100%), solución salina y se limpian. La composición de la solución salina fue (en mmoles / L): 136 NaCl, 11 glucosa, 4,7 KCl, 2,4 CaCl 2, 1,1 MgCl 2, 1 NaHCO 3, 10 HEPES, pH = 7,2). Todos los experimentos se realizaron a una temperatura constante, 26,0 ± 1,0 ° C. El epineuro y perineuro se eliminaron a un estereoscopio disección utilizando unas pinzas finas y microalfileres para permitir un mejor acceso de los fármacos a las fibras nerviosas. El nervio se montó en un baño de grabación de tres cámaras de plexiglás, que se describe en otra parte [29] , [30] . El baño de grabación consistió en la grabación (R en la fig. 5b ), perfusión (P) y estimulantes (S) cámaras, cada una con un volumen de 12 ml. La NCAP ( Fig. 5a ) fue generado mediante la estimulación (1 Hz), la parte del nervio en la cámara de estimulante y se registró en la cámara de registro cada segundo usando métodos electrofisiológicos estándar. El NCAP se monitorizó durante todo el experimento como una indicación de la vitalidad de las fibras nerviosas en el baño de grabación. Para exponer el nervio para el compuesto bajo investigación (2-H, lidocaína) el compuesto se diluyó en solución salina oxigenada a la concentración deseada, y cambios menores en el pH fueron corregidos. Las concentraciones de 2-H y probado lidocaína se dan en la Tabla 2 . Entonces, el 12,0 ml de solución salina en la cámara de perfusión fue reemplazada con solución salina diluida con 2-H o lidocaína. El efecto anestésico local comenzó con una rápida disminución de la NCAP. Inmediatamente después de la NCAP fue eliminado, el compuesto + solución salina se eliminó y el nervio fue lavado. Entonces, la recuperación de la NCAP en solución salina normal de estancamiento se controló durante 24 h. Vale la pena señalar que el baño de grabación está diseñado de tal manera que las cámaras con la solución salina y 2 H-(los nervios y los electrodos de registro) fue protegido del aire mediante el uso de la tapa (c en la fig. 5b ) para evitar la evaporación de los volátiles 2-H. La solución salina con 2-H se añadió a través de una abertura de diámetro pequeño en la cubierta.

Análisis de los datos estadísticos-

Para el análisis de datos, la amplitud de las nCAPs, estimado a partir de línea de base a pico ( Fig. 5 ), se midieron en un momento específico (cada 1,0 s, 1,0 min o h 1,0) y se expresaron como un porcentaje de la amplitud de la NCAP en t = 0 (lo que se consideró como 100%). En los experimentos neurofarmacológicas, el tiempo t = 0 se considera el tiempo antes de la aplicación del compuesto bajo investigación. Las curvas de respuesta de tiempo-(o curvas de vitalidad) para una concentración específica de 2-H y lidocaína se trazaron utilizando valores derivados de los experimentos replicados (n) que se promediaron y se expresó como una media ± error estándar de la media (SEM). Las concentraciones ensayadas se dan en la Tabla 1 . De las curvas de respuesta de tiempo generados utilizando el programa GraphPad Prism 5,0, la TI 50 y TI 100 se calcula para una concentración específica de 2-H y lidocaína. Usando los valores de TI 50, fue posible estimar el IC 50 para 2-H y lidocaína. Los datos se ajustaron en el programa GraphPad Prism 5,0 usando una ecuación de una fase de decaimiento exponencial para la IC 50. Los datos se analizaron por ANOVA de una vía y las pruebas de Bonferroni post hoc, cuando sea necesario. La significación se determinó utilizando ensayo t de Student o ANOVA según sea apropiado (p <0 span="span">

Químicos

KCl, NaCl y MgCl2 fueron de Panreac (España), HEPES Biochemica de Fluka (Suiza), la glucosa de Riedel-de Haen (Alemania) y NaHCO3 de Merck (Alemania). La lidocaína se adquirió de Sigma (Deisenhofen, Alemania), 2-heptanona de Sigma-Aldrich (Alemania).

Información complementaria



Tabla S1.
Precisión intra-e inter-día y los datos de precisión de 2-H cálculos.
(DOC)

Reconocimientos



Damos las gracias a la Unión de Apicultores chipriota para la prestación de los especímenes para los ensayos. Damos las gracias a Gikas Evagelos para asesoramiento analítico, Dimitris Fotaroudis por el apoyo estadístico, ChanTest Corporation (Cleveland OH, EE.UU.) para el apoyo en los experimentos de patch-clamp y Wardrop Sharilynn para revisar el documento. Damos las gracias a Carpentier Anaïs por el apoyo durante SEM fotografía, que se beneficiaron de las instalaciones y la experiencia de la Unidad de Biología Celular Imagif del campus Gif ( www.imagif.cnrs.fr ), que se apoya en Essonne el Conseil Général de l'.

Autor Contribuciones



Concebido y diseñado los experimentos: AP GT MW. Realiza los experimentos: AP GT CP GA AK MW ALS en NF. Analizados los datos: AP GT CP GA AK MW ALS en NF. Escribió el documento: AP GT CP GA.

Referencias 

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Fuente: http://www.plosone.org


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