Fuente: http://www.plosone.org
Abstracto
La microflora intestinal de la abeja de miel, Apis mellifera, está recibiendo cada vez más atención como un posible factor determinante de la salud de las abejas y su eficacia como polinizadores. Los estudios se han centrado principalmente en los taxones microbianos que aparecen numéricamente dominante en el intestino de la abeja, con la suposición de que el estatus dominante sugiere su potencial importancia para la salud de las abejas. Sin embargo, numéricamente menor tasa también puede influir en la eficacia de las abejas como polinizadores, sobre todo si no sólo están presentes en el intestino, pero también capaz de crecer en el néctar floral y alterar sus propiedades químicas. No obstante, no se entiende bien si las abejas de miel tienen algna preferencia alimentaria a favor o en contra de néctar colonizado por especies microbianas específicas. Para probar si las abejas exhiben una preferencia, se realizó una serie de experimentos de campo en un apiario usando néctar sintética inoculada con especies específicas de bacterias o levaduras que se había aislado en el intestino de la abeja, pero se consideran componentes menores de la microflora intestinal.También se han encontrado que estas especies en el néctar floral. Nuestros resultados indicaron que las abejas de miel evitarn néctar colonizado por las bacterias astilbes Asaías, Erwinia tasmaniensis, y Lactobacillus kunkeei, mientras que el Metschnikowia reukaufiilevadura no afectó a la preferencia de alimentación de los insectos. Nuestros resultados también indican que la evitación de bacterias colonizadas néctar no fue causada por la presencia de las bacterias por sí misma, sino por los cambios químicos a néctar producidas por la bacteria. Estos hallazgos sugieren que los microbios del intestino no sólo pueden afectar a la salud de las abejas como simbiontes, pero que algunos de los microbios, posiblemente, puede afectar a la eficacia de la A. mellifera como polinizadores al alterar la química del néctar y que influyen en su comportamiento de forrajeo.
Cifras
Cita: Bueno AP, Gauthier M-PL, Vannette RL, Fukami T (2014) Las abejas de miel Evite Nectar colonizados por especies bacterianas Tres, pero no por una especie de levadura, aislados del Gut Bee. PLoS ONE 9 (1): e86494. doi: 10.1371/journal.pone.0086494
Editor: E. Nigel Raine, Royal Holloway University of London, Reino Unido
Recibido: Marzo 2, 2013; Aceptado: 7 de diciembre de 2013; Publicado: 22 de enero 2014
Copyright: © 2014 Good et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License , que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan.
Financiación: El Departamento de Biología y el Terman Fellowship de la Universidad de Stanford y la Fundación Nacional para la Ciencia (número de adjudicación: DEB1149600) apoya esta investigación. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.
Introducción
Factores que afectan a la salud y la eficacia de la Apis mellifera abeja de la miel como polinizadores son de gran interés debido a su importancia agrícola [1] . Un posible factor que está recibiendo cada vez más atención es la microflora intestinal de las abejas [2] . Descrito como uno de los mayores reservorios inexploradas de la diversidad microbiana [3] , el intestino del insecto lleva un conjunto diverso de bacterias simbióticas [4] - [6] . Por ejemplo, las especies pertenecientes a géneros de bacterias del ácido láctico, como Lactobacillus yBifidobacterium, se encuentran frecuentemente en el intestino de la abeja de la miel y pueden defender al huésped contra patógenos [7] . Del mismo modo, las bacterias del ácido acético tales como las del género Asaia y Gluconobacter se han indicado como simbiontes facultativos de las abejas y otros insectos que se alimentan de azúcar [8] - [11] , y también podría ser beneficioso para el host a través de la supresión de las bacterias patógenas .
Los estudios sobre la microflora intestinal de abejas se han centrado principalmente en los taxones que aparecen numéricamente dominante en el intestino, con la suposición de que el estado dominante como simbiontes sugiere que son particularmente importantes para la salud de las abejas. Sin embargo, los taxones numéricamente menor en el intestino, incluyendo las dos especies bacterianas y de levadura, también puede influir en la eficacia de las abejas como polinizadores. Esta posibilidad puede ser especialmente probable si los microbios no sólo están presentes en el intestino, pero también capaces de crecer en los recursos alimentarios de abejas, incluyendo el néctar de flores, y la alteración de sus propiedades químicas. Por ejemplo, las especies aeróbicas de bacterias y levaduras se pueden encontrar miembros sólo como menores de la microflora en el intestino de abeja [12] , que puede ser baja en la disponibilidad de oxígeno [12] , [13] , pero pueden alcanzar una alta abundancia en el néctar de flores . Estos microbios pueden afectar a las propiedades químicas de néctar y, en consecuencia, su atractivo para los insectos polinizadores [14] - [17] .
Trabajos recientes han sugerido que los efectos del crecimiento microbiano en el néctar de la preferencia de los polinizadores pueden diferir entre las especies microbianas, al menos cuando los abejorros o colibríes son los polinizadores [15] - [17] . Sin embargo, se conoce poco si las abejas se alimentan de preferencias para los microbios específicos en néctar [18] .Como primer paso hacia la respuesta a esta pregunta, se realizó una serie de experimentos de campo en un pequeño apiario en California. Nuestro objetivo era poner a prueba la hipótesis de que el crecimiento microbiano en el néctar afecta la preferencia del néctar de las abejas melíferas, dependiendo de la identidad de la especie de las bacterias y levaduras. Con el fin de probar esta hipótesis, primero se aisló e identificó posibles microbios abeja asociada que fueron capaces de crecer en el néctar y utilizan algunas de estas cepas en los experimentos de campo.
Materiales y Métodos
Sitio de Estudio
El estudio se realizó en las instalaciones de crecimiento de las plantas en el campus de la Universidad de Stanford, ubicada en la península de San Francisco de California. Este sitio tenía un pequeño apiario que consta de aproximadamente 160 colmenas de abejas de miel (Figura 1a ).
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Figura 1. Experimentales apiarios y artificiales arreglos florales.
(A) Apiario con una gran variedad de flores artificiales dispuestos en la sombra, 1-2 metros de las colmenas. (B) se destacan flor Experimental en la que las abejas pueden ver alimentándose de las flores contienen néctar sintética inoculada con microbios.Cada tratamiento estuvo representado una vez en cada stand. (C) de flores experimental que muestra una alimentación de abeja de la miel de néctar sintético.
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.g001Muestreo microbiano en el intestino de la abeja
Para obtener algunas de las cepas microbianas en el intestino de la abeja, se capturaron un total de 150 abejas en el colmenar utilizando contenedores amarillos llenos de agua jabonosa para atrapar abejas vivas. Para el primer experimento de campo (ver el diseño experimentalmás adelante), colocamos 10 contenedores alrededor de las colmenas a las 10:00 AM y se recuperaron 55 abejas vivas atrapadas en los contenedores a las 3:30 pm el 29 de febrero de 2012. Hemos utilizado 50 de los 55 las abejas para la toma de muestras de microbios. Para el segundo y tercer experimentos de campo (véase el diseño experimental más adelante), colocamos 20 contenedores a las 8:00 AM y se recuperaron 80 abejas vivas a las 1:00 PM el 29 de junio de 2012. Además, colocamos 8 contenedores a las 10:30 AM y se recuperaron 60 abejas vivas a las 1:00 PM del 30 de junio de 2012. De los aproximadamente 140 abejas atrapadas en estos dos días, hemos utilizado 100 para el muestreo microbiano.
Inmediatamente después de la eliminación de los contenedores, las abejas vivas se colocaron en un refrigerador a 4 º C durante 3 minutos para frenar el movimiento. Las abejas fueron disecados transversalmente para separar la picadura, abrir el segmento posterior del abdomen y retirar el intestino completamente intacta que contiene el intestino. Dentro del intestino probamos la cosecha, un órgano central en la producción de alimentos de la abeja, que se encuentra entre el esófago y el ventrículo y se utiliza para la recolección y transporte de néctar a la colmena. El contenido de cada cultivo se colocaron a continuación en tres repeticiones de dos tipos de placas (seis placas por muestra gut): (1) agar levadura-malta (LMA; Difco, Sparks, MD, EE.UU.) suplementado con 100 mg / l de ampicilina para prevenir el crecimiento bacteriano, pero permitir el crecimiento de la levadura, y (2) YMA suplementado con 100 mg / l de cicloheximida para prevenir el crecimiento de la levadura, pero permiten el crecimiento bacteriano. Estudios previos utilizaron medios similares para aislar microbios de abeja intestino [19] , [20] .
Las placas se incubaron a 25 ° C durante 3 a 5 días en condiciones aeróbicas. Observamos que las bacterias y levaduras que se encuentran en el intestino abeja de la miel que requieren condiciones anaeróbicas no han sobrevivido en estas condiciones. Las placas no fueron incubadas durante el mismo período de tiempo, debido a la longitud de tiempo requerido para el crecimiento de colonias parecía variable de entre las especies y que estábamos interesados en el aislamiento de múltiples especies. Para cada muestra de intestino, en la mayoría de tres réplicas de las colonias morfológicamente distintos fueron sub-rayada en las placas. Las muestras de todas las abejas se agruparon entonces con el fin de identificar morfotipos de colonias comunes. Hasta tres réplicas de cada morfotipo distinta fueron elegidos para la extracción de ADN y amplificación con el kit de PCR de tejido Sigma RED Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, EE.UU.), que se utilizó de acuerdo con el fabricante de especificaciones. Una porción del gen 16S rRNA para las bacterias y el gen 18S de levaduras fueron amplificados utilizando cebadores bacterianos, U519F y U1099R [21] , y los cebadores fúngicos, NL1 y NL4 [22] . Los amplicones fueron secuenciados por la proteína de la Universidad de Stanford y de las instalaciones de ácido nucleico, usando un ABI-3130 × L Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA).
Las secuencias consenso se agruparon en unidades taxonómicas operacionales (UTO) en base a 98% de similitud, utilizando Geneious Pro (Biomatters Ltd, Auckland, Nueva Zelanda).Consenso de secuencias de cada OTU se identificaron utilizando Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) búsquedas en contra del Centro Nacional de Información Biotecnológica de GenBank. Se recuperó un total de 16 especies (14 bacterianas y fúngicas 2) a partir de los 150 disecciones intestinal ( Tabla 1 , Figura S1 ). De éstos, las cepas de las especies que se encuentran comúnmente se mantuvieron en YMA y recién estrías 2-4 días antes de cada uno de los experimentos de campo se describen a continuación.
Tabla 1. Asignaciones taxonómico de microorganismos aislados de A. melliferaintestino especímenes en este estudio.
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.t001Experimentales Flores
Para los experimentos en el apiario, fueron hechos a mano 40 flores artificiales. Las flores fueron diseñadas para fomentar las visitas de abejas [23] y consistieron en papel en forma de girasol de color amarillo con una tapa de tubo de centrífuga de 1,5 ml adjunta al centro ( Figura 1b, c ). Nos apegamos a cuatro de las flores para cada uno de 10 palos de bambú pintado verde-usando alambre de floristería y cinta de floristería verde. Los palos eran de aproximadamente 1 m de altura. En el apiario, las 10 gradas tenían 4 flores con cada uno conteniendo uno de los cuatro tratamientos que se detallan a continuación. Los stands se colocaron aproximadamente 1-2 m de distancia de las colmenas ( Figura 1a ).
Diseño Experimental
Uso de las flores artificiales, se llevaron a cabo tres experimentos. En los dos primeros experimentos, cada vial se llenó con 200 l de néctar sintético que había sido inoculado con: (1) no hay bacterias o levaduras (un néctar de control), (2) astilbes Asaías (bacteria Gram negativa), (3) ya sea Erwinia tasmaniensis (bacteria Gram negativa) o Lactobaccillus kunkeei(bacteria Gram positiva), o (4) Metschnikowia reukaufii (levadura). Cuando se prepara el néctar sintética microbio-inoculados, se incubaron todas las preparaciones a 25 º C durante 4 días antes de cada día de cada experimento en esterilizada por filtración, 15% w / v solución de sacarosa suplementado con 0,32 mM de aminoácidos de la caseína digerida. Las concentraciones de sacarosa y de aminoácidos fueron seleccionados con el fin de imitar típica néctar de flores [24] - [26] . Las colonias individuales de las especies apropiadas se diluyeron a continuación hasta 200 células por microlitro de cada día experimental. Aproximadamente 1,5 ml de esta suspensión diluida se añadió a 8 ml de la solución de sacarosa inmediatamente antes del inicio del experimento de campo cada día. Por lo tanto, un suministro fresco de aproximadamente 32 células por solución néctar l se presentó a las abejas cada día de la experimentación. Las densidades celulares de 10 células de levadura por 4 l [27] y 30 UFC (unidades formadoras de colonias bacterianas) por l [17] Se han observado comúnmente en néctar de flores en el campo. El néctar de control se preparó de la misma manera, excepto que no fue inoculado con microbios. En lugar de ello, w / v de solución de sacarosa suplementado con 0,32 mM de aminoácidos de la caseína digerida se añadió 1,5 ml de filtro esterilizado 15%. Añadimos los mismos aminoácidos en todos los tratamientos, incluyendo el control, ya que es bien conocido que el tipo de proteína puede afectar la preferencia de las abejas [28] .
En el primer experimento, llevado a cabo en 13 a 15 abril 2012, A. astilbes y E. tasmaniensisse utilizaron debido a que parecían ser las bacterias cultivables más comunes en el primer conjunto de muestras del intestino de la abeja. En el segundo experimento, llevado a cabo en 6 a 12 septiembre 2012, L. kunkeei se utilizó en lugar de E. tasmaniensis porque L. kunkeeise encontró con mayor frecuencia en el segundo conjunto de muestras intestinales. M. se utilizó reukaufii porque es la especie de levadura de néctar que habitan dominantes en el néctar de flores de muchas especies de plantas [29] - [34] y porque nos encontramos en nuestras muestras intestinales de abeja, así, a pesar de que no está claro si es o no M.reukaufii replica en el intestino.
El tercer experimento, llevado a cabo en 17 a 20 septiembre 2012, era idéntica en diseño a los dos primeros experimentos, excepto que, en lugar de utilizar E. tasmaniensis - o L. néctarinoculado-kunkeei como el tercer grupo de tratamiento, se utilizó el néctar que fue inoculado con A. astilbes como en el segundo grupo de tratamiento, pero esterilizada por filtración (tamaño de poro: 0,2 micras). inmediatamente antes de que el uso experimental A. astilbesson bacilos cortos que miden 0,6 por 1,2 a 2,0 micras [35] . Se utilizó el tratamiento néctar filtrada para determinar si las abejas respondieron a la presencia de A. astilbes en néctar per se o los cambios en las propiedades químicas del néctar causadas por A. astilbes.
Durante cada uno de los tres experimentos, nuevos viales estériles que contienen 200 l de néctar sintética microbio-inoculado fresco fueron utilizados cada día. Se asignaron Los cuatro flores en cada stand al azar a uno de los cuatro grupos de tratamiento cada día. Dos de los soportes 10 se embolsaron con malla (tamaño de malla: 1 mm) para denegar el acceso por las abejas con el fin de dar cuenta de la reducción de peso néctar por evaporación.Aproximadamente dos horas después del inicio del experimento cada día, el néctar restante del vial de cada flor se tapó, se trajo de vuelta al laboratorio, y se pesó usando una microbalanza para estimar cambios en el volumen. Cada día, el experimento comenzó aproximadamente a las 10:00 PM. En los días más cálidos, las abejas visitaron las muestras de néctar con más frecuencia, por lo que recuperar las muestras antes de tener cantidades perceptibles de volumen de néctar para pesar.
Aunque no observamos directamente las flores en el campo durante todo el período experimental de 2 horas cada día, nuestras extensas observaciones indicaron que las abejas eran la principal, si no el único, animales que visitaron las flores ( Figura 1 ). Se realizaron observaciones directas de las flores artificiales durante las primeras 15 a 30 minutos y los últimos 10-15 minutos de cada uno de los períodos experimentales de 2 horas. Motivos logísticos nos impidieron hacer las observaciones directas para todo el período de 2 horas. Los únicos otros visitantes florales que observamos eran chaquetas amarillas (Vespula spp.), Y que rara vez se observa (sólo tres veces durante un experimento de una semana de duración) que visitan las flores artificiales. Además, incluso cuando una chaqueta amarilla se posó en una flor artificial, no se observó ninguno de ellos consume el néctar artificial. Por el contrario, se observaron las abejas de la miel con frecuencia visitar y alojarse en las flores, y era posible ver su trompa en el líquido ( Figura 1 ).
En los tres experimentos, la temperatura ambiente en el momento de la días se llevó a cabo el experimento fue de aproximadamente 16-25 ° C, con poco o ningún viento. El área fue bien la sombra de la ventana experimental 1-2 horas.
Efecto de la inoculación microbiana en Nectar Química
Debido a que los resultados de nuestros experimentos de campo indicaron que las abejas evitarse néctar colonizado-bacterias no a causa de la presencia de las bacterias de por sí, pero debido a los cambios en la química del néctar inducidos por las bacterias ( Figura 2 ), se realizó un experimento adicional en el laboratorio para investigar el efecto de la inoculación microbiana en la química del néctar. Para ello, hemos preparado el néctar sintética microbio inoculado exactamente como lo hicimos para los experimentos de campo, utilizando las mismas cepas de A. astilbes y M. reukaufii como para el experimento principal y una cepa deErwinia sp. que hemos aislado a nivel local a partir del néctar de flores de Mimulus aurantiacus.En este experimento, no usamos la cepa de L. kunkeei o E. tasmaniensis utilizado en el experimento principal, debido a que los cultivos de reserva de estas cepas se habían perdido.Después de la incubación de cuatro días, se midió el pH, H 2 O 2, y sacarosa, glucosa, fructosa y las concentraciones de las muestras incubadas néctar, usando los métodos descritos anteriormente [17] . Nos hemos centrado en estas medidas porque la investigación anterior indicó que los microbios podrían inducir grandes cambios en estas propiedades químicas y que los cambios podrían tener un efecto sobre los visitantes de flores [17] , [36] -[38] . Se utilizaron un total de 20 unidades experimentales, es decir, 4 tratamientos (control, A. astilbes, M. reukaufii y Erwinia sp.) × 5 repeticiones.
Figura 2. Efectos de las inoculaciones microbianas en la remoción de néctar de las abejas melíferas.
(A) Los resultados del experimento 1, que muestran que la remoción de néctar dependía de tratamiento microbiano (Metschnikowia reukaufii, astilbes Asaías o Erwinia tasmaniensis). (B) Los resultados del experimento 2, que muestran que el néctar inoculado con A. astilbes o Lactobacillus kunkeei se retiró menos de néctar inoculado con levadura (M. reukaufii) o microorganismos. (C) Los resultados del experimento 3, que muestran que el néctar inoculado con A. astilbes o inoculado con él y luego esterilizado filtrado se eliminó menos de néctar levaduras inoculadas y control. Las barras indican la media ± 1 SE. Cartas sobre las barras indican tratamientos que difieren significativamente (prueba de Tukey HSD, α = 0,05).
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.g002Análisis estadístico
La cantidad de néctar eliminado por las abejas de cada vial se estimó como a - b, donde a es el peso (g) del néctar restante en el vial de control de evaporación más el vial de sí mismo después de la exposición a 2-hora en el campo, y b es el peso (g) del néctar restante en el vial focal más el propio vial después de la exposición a 2-hora en el campo. Se evaluaron los efectos de las inoculaciones microbianas en la eliminación néctar utilizando un modelo mixto lineal, con el tratamiento microbiano como efecto fijo y día experimental como un efecto aleatorio, seguido de una prueba de HSD de Tukey para evaluar las diferencias significativas entre los niveles de tratamiento, el uso de paquetes nLME [39 ] y multcomp [40] en R v 2.15.0[41] . Para examinar la variación en los efectos del tratamiento con el tiempo, también realizó análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para cada día, con los tratamientos microbianos como la variable predictora y el néctar eliminado como variable de respuesta utilizando R v 2.15.0 [ 41] . Dentro de cada experimento (experimentos 1 a 3), una corrección secuencial de Bonferroni se utilizó para tener en cuenta múltiples pruebas durante varios días. ANOVA, seguido por una prueba HSD de Tukey, se utilizó para probar el efecto de las especies inoculadas en cada medición química.
Resultados
En las primera y segunda experimentos, de 3 a 31% menos de néctar de las flores se eliminó experimentales cuando se inoculan con A. astilbes, E. tasmaniensis o L. kunkeei que con M.reukaufii o sin microorganismos (experimento 1: El tratamiento de F 3, 90 = 6.97, P <0 a="" href="http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=es&prev=/search%3Fq%3DThe%2Bgut%2Bmicroflora%2Bof%2Bthe%2Bhoney%2Bbee,%2BApis%2Bmellifera,%2Bis%2Breceiving%2Bincreasing%2Battention%2Bas%2Ba%2Bpotential%2Bdeterminant%2Bof%2Bthe%2Bbees%25E2%2580%2599%2Bhealth%2Band%2Btheir%2Befficacy%2Bas%2Bpollinators.%26biw%3D1366%26bih%3D643&rurl=translate.google.com.uy&sl=en&u=http://www.plosone.org/article/info%253Adoi%252F10.1371%252Fjournal.pone.0086494%3Bjsessionid%3DC0178CB814D9114EDE34A46E3203866F&usg=ALkJrhhIzCRbttA0-VDiJ7Zx_lbhIaeVMQ#pone-0086494-g002" style="color: #3c63af; text-decoration: none;">Figura 2a
En el experimento que investigó el efecto de la inoculación microbiana en la química del néctar, las tres especies pH reducido significativamente, y A. astilbes causaron una reducción mayor que M. reukaufii y Erwinia sp. ( Figura 3a ). No se detectaron diferencias significativas en H 2 O 2 o la concentración de sacarosa entre cualquiera de los tratamientos ( Figura 3b, c ).A. astilbes aumentaron las concentraciones de glucosa y de fructosa, mientras que M.reukaufii y Erwinia sp. no causó cambios detectables ( Figura 3d, e ).
Figura 3. Efectos de inoculaciones microbianas en: (a) pH, (b) H 2 O 2, (c) sacarosa, (d) de glucosa, y (e) las concentraciones de fructosa en néctar.
Bares y cartas son como en la Figura 2 .
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.g003Discusión
Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan apoyo a la hipótesis de que el crecimiento microbiano en el néctar afecta a la alimentación de preferencia de abejas de la miel, y que el efecto depende de la identidad de las especies microbianas. Específicamente, nuestros datos indican que las abejas prefieren libre de colonias de las tres especies de bacterias aeróbicas que aislamos en el intestino de abeja néctar, mientras que la levadura néctar que habitan en M. reukaufii tuvo ningún efecto sobre la preferencia de alimentación de las abejas. Nuestros datos también indican que la evitación de bacterias colonizadas néctar no fue causada por la presencia de las bacterias por sí misma, sino por los cambios químicos a néctar producidas por la bacteria. En general, este estudio puede sugerir que los microbios intestinales que habitan no sólo afectan a la salud de los A. mellifera como simbiontes, pero potencialmente también influir en su comportamiento de alimentación alterando la química del néctar.
Esperábamos que las abejas prefieren el néctar inoculado con la bacteria debido a que la literatura sugiere que los taxones bacteriana se utilizó podría ser beneficiosa como simbiontes en el intestino de la abeja de la miel [3] , [4] , [7] - [9] , [42] - [44] . Aunque la evidencia para el potencial de E. tasmaniensis a ser un importante simbionte de insectos no es definitiva [45] ,L. kunkeei se ha indicado que es un simbionte mutualista de A. mellifera [46] , y varias especies de Asaia se han indicado como simbiontes dominantes de algunas especies de insectos, por ejemplo, el mosquito Anopheles stephensi [8] , [9] y la titanus Scaphoideussaltahojas [8] , [47] . Secuenciación molecular indicó que A. astilbes y L. kunkeei son relativamente estrechamente relacionados con uno de los grupos de las bacterias supuestos dominantes (el Alfa-2.2 filotipo y la Firma-4 filotipo, respectivamente) en el intestino de la abeja[43] , pero ninguna de nuestras cepas bacterianas fueron anidados filogenéticamente en cualquiera de estos grupos ( Figura S1 ). Incluso si nuestras cepas bacterianas no son numéricamente dominantes en el intestino de la abeja, esto puede no indica necesariamente que sean funcionalmente irrelevante como simbiontes, o como nuestros resultados sugieren ahora, como modificadores de abeja comportamiento de alimentación.
Los resultados del experimento que investigó el efecto de la inoculación microbiana en la química del néctar sugieren que los cambios en cualquiera de néctar de pH o concentración de glucosa o fructosa podrían ser una razón por qué las abejas pueden evitar que las bacterias inoculadas néctar. Sin embargo, aunque A. astilbes y Erwinia sp. afectado a la química del néctar de manera diferente ( Figura 3 ), esta diferencia no parece afectar la eliminación de néctar de las abejas ( Figura 2 ). Por otra parte, se ha indicado que las abejas prefieren sacarosa sobre la glucosa o fructosa cuando cada uno se ofrece como un solo azúcar [48] , por lo que el aumento de la glucosa y la fructosa puede que no sea una explicación plausible de las opciones de comportamiento. Además, es intrigante que los cambios medidos en las propiedades de néctar en el M. reukaufii y Erwinia sp. tratamientos fueron similares, sin embargo M. reukaufii no afectó forrajeo mientras que Erwinia hizo. Una posible explicación de este contraste es que la Erwinia sp. utilizado en el experimento para probar el efecto sobre las propiedades de néctar fue funcionalmente diferente de la E. tasmaniensis utilizado en el experimento de campo en la preferencia de abeja. Otra posibilidad es que M. reukaufii yErwinia spp. tenido efectos diferentes en algunos aspectos importantes de la química del néctar que no nos medimos. Por ejemplo, las especies pueden haber diferido en su capacidad para producir etanol. Etanol producido por microorganismos en el néctar se ha sugerido para alterar de forrajeo de néctar por los insectos, por ejemplo, avispas consumir orquídea néctar[14] . También es posible que otros compuestos orgánicos volátiles podrían desempeñar un papel [48] , pero las pruebas estas posibilidades requerirían experimentos adicionales.
La capacidad de A. astilbes para aumentar los niveles de glucosa y de fructosa sin reducir sacarosa pueden parecer desconcertante ( Figura 3 ). Es probable, sin embargo, que la reducción en la concentración de sacarosa que condujo al aumento de la concentración de glucosa y la fructosa era demasiado pequeño para ser detectado en contra de la variación inicial que existía entre las réplicas en tratamientos. En contraste, en glucosa y fructosa, un aumento de una magnitud similar podría ser detectada con mayor potencia estadística debido a la variación inicial de la glucosa y la fructosa era esencialmente inexistente; hubo inicialmente sin glucosa o fructosa en nuestra néctar artificial.
Microbiota intestinal son diversas, que contiene muchas más especies que los cuatro nos centramos en este estudio [43] . Nuestro propósito no era caracterizar la comunidad microbiana del intestino, sino que nos centramos en las cepas bacterianas y de levaduras seleccionadas se encuentran tanto en el intestino de las abejas y el néctar floral. Nuestros resultados sugieren que puede ser útil para investigar los efectos de una mayor variedad de especies para evaluar la generalidad de nuestros resultados. Muchos, aunque probablemente no todas, de otras especies simbióticas tubo digestivo puede ser capaz de crecer en néctar.Sería interesante utilizar diferentes condiciones de cultivo, incluyendo aquellos que involucran O bajado 2 niveles [49] , [50] , para aislar las diferentes cepas, incluidas las que pertenecen a los grupos dominantes de la microflora intestinal identificados por estudios recientes [43 ] ,[51] - [53] , y repita la abeja de forrajeo experimento preferencia. Vale la pena señalar, sin embargo, que más de oxígeno que normalmente pueden estar disponibles en el néctar que en el intestino. Por lo tanto, es posible que sólo un subconjunto, en su caso, de las bacterias que requieren bajo niveles de O 2 para el crecimiento puede reproducir en néctar a un grado suficiente para tener un gran efecto sobre las abejas. Además de la realización de pruebas de comportamiento utilizando inoculaciones de especies únicas de especies microbianas adicionales, el establecimiento de inoculaciones múltiples especies sería interesante como el néctar de flores es a menudo probable que contenga más de una especie. Este tipo de trabajo avanzará aún más nuestra comprensión de los efectos de los microbios intestinales en el néctar de las opciones de forrajeo de las abejas.
Si las bacterias néctar colonizar influyen visitas de flores por las abejas de miel, su comportamiento de forrajeo alterado puede tener consecuencias para la polinización. Aunque hemos utilizado una mezcla realista de azúcares y aminoácidos en el néctar de síntesis, los estudios futuros podrían utilizar las flores de verdad para confirmar la relevancia de nuestros hallazgos a la polinización por las abejas. En este contexto, el contraste en respuesta conductual que encontramos entre el efecto negativo de la colonización bacteriana de néctar y el efecto neutro de la colonización néctar de levadura es especialmente intrigante. M. reukaufii, que es la especie más dominante de la levadura en el néctar en nuestra región de estudio[31] y muchos otros lugares en todo el mundo [29] , [30] , [32] - [34] , se ha demostrado que crecer rápidamente y alcanzar un alto densidad en néctar, posteriormente cambiando las propiedades químicas de néctar considerablemente [17] , [54] , [55] . Aun así, esta especie no parece afectar de forrajeo de abeja, mientras que las bacterias que estudiamos lo hicieron.Este hallazgo es consistente con nuestro trabajo reciente sobre el consumo de néctar por colibríes, en la que nos encontramos que el néctar de forrajeo de las aves se ha reducido como consecuencia de la colonización de néctar por una bacteria ( Gluconobacter sp.), pero no porM. reukaufii [17] . En conjunto, nuestros resultados ponen de relieve la importancia de estudiar los efectos de la colonización microbiana especies específicas con el fin de comprender sus efectos potenciales sobre la búsqueda de alimento de las abejas y la polinización.
Información de Apoyo
Las relaciones filogenéticas, basadas en secuencias bacterianas 16S rRNA, de las especies bacterianas utilizadas en nuestro experimento y las incluidas en las figuras S3B, E y F de Martinson et al. (2011).
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.s001
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Cambios en el día de experimentación en la cantidad de néctar removidos.
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.s002
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Agradecimientos
Agradecemos Waldan Kwong para obtener información sobre los métodos de cultivo, Melinda Belisle, Ray Von Itter, y Dave Wilson para el campo y la asistencia de laboratorio, y Rodolfo Dirzo, Sharon Long, Nigel Raine, Erin Jo Tiedeken, y los miembros del grupo de ecología de comunidades en Stanford Universidad de los comentarios sobre los borradores del manuscrito.
Contribuciones de autor
Concebido y diseñado los experimentos: APG MPLG FT. Realizado los experimentos: APG MPLG RLV. Analizados los datos: APG RLV. Herramientas reactivos Contribuido / materiales / análisis: APG MPLG RLV TF. Escribió el documento: APG TF. Revisado el manuscrito: APG MPLG RLV TF.
Referencias
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