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ASAMBLEA NACIONAL DE APICULTORES URUGAUY 19 DE NOVIEMBRE 2016

lunes, 3 de febrero de 2014

Las abejas evitan el néctar colonizado por tres especies de bacterias y no por una especie de levadura aislada del su tracto digestivo.

Fuente: http://www.plosone.org


Abstracto



La microflora intestinal de la abeja de miel, Apis mellifera, está recibiendo cada vez más atención como un posible factor determinante de la salud de las abejas y su eficacia como polinizadores. Los estudios se han centrado principalmente en los taxones microbianos que aparecen numéricamente dominante en el intestino de la abeja, con la suposición de que el estatus dominante sugiere su potencial importancia para la salud de las abejas. Sin embargo, numéricamente menor tasa también puede influir en la eficacia de las abejas como polinizadores, sobre todo si no sólo están presentes en el intestino, pero también capaz de crecer en el néctar floral y alterar sus propiedades químicas. No obstante, no se entiende bien si las abejas de miel tienen algna preferencia alimentaria a favor o en contra de néctar colonizado por especies microbianas específicas. Para probar si las abejas exhiben una preferencia, se realizó una serie de experimentos de campo en un apiario usando néctar sintética inoculada con especies específicas de bacterias o levaduras que se había aislado en el intestino de la abeja, pero se consideran componentes menores de la microflora intestinal.También se han encontrado que estas especies en el néctar floral. Nuestros resultados indicaron que las abejas de miel evitarn néctar colonizado por las bacterias astilbes Asaías, Erwinia tasmaniensis, y Lactobacillus kunkeei, mientras que el Metschnikowia reukaufiilevadura no afectó a la preferencia de alimentación de los insectos. Nuestros resultados también indican que la evitación de bacterias colonizadas néctar no fue causada por la presencia de las bacterias por sí misma, sino por los cambios químicos a néctar producidas por la bacteria. Estos hallazgos sugieren que los microbios del intestino no sólo pueden afectar a la salud de las abejas como simbiontes, pero que algunos de los microbios, posiblemente, puede afectar a la eficacia de la A. mellifera como polinizadores al alterar la química del néctar y que influyen en su comportamiento de forrajeo.

Cifras


Introducción


Factores que afectan a la salud y la eficacia de la Apis mellifera abeja de la miel como polinizadores son de gran interés debido a su importancia agrícola [1] . Un posible factor que está recibiendo cada vez más atención es la microflora intestinal de las abejas [2] . Descrito como uno de los mayores reservorios inexploradas de la diversidad microbiana [3] , el intestino del insecto lleva un conjunto diverso de bacterias simbióticas [4] - [6] . Por ejemplo, las especies pertenecientes a géneros de bacterias del ácido láctico, como Lactobacillus yBifidobacterium, se encuentran frecuentemente en el intestino de la abeja de la miel y pueden defender al huésped contra patógenos [7] . Del mismo modo, las bacterias del ácido acético tales como las del género Asaia y Gluconobacter se han indicado como simbiontes facultativos de las abejas y otros insectos que se alimentan de azúcar [8] - [11] , y también podría ser beneficioso para el host a través de la supresión de las bacterias patógenas .

Los estudios sobre la microflora intestinal de abejas se han centrado principalmente en los taxones que aparecen numéricamente dominante en el intestino, con la suposición de que el estado dominante como simbiontes sugiere que son particularmente importantes para la salud de las abejas. Sin embargo, los taxones numéricamente menor en el intestino, incluyendo las dos especies bacterianas y de levadura, también puede influir en la eficacia de las abejas como polinizadores. Esta posibilidad puede ser especialmente probable si los microbios no sólo están presentes en el intestino, pero también capaces de crecer en los recursos alimentarios de abejas, incluyendo el néctar de flores, y la alteración de sus propiedades químicas. Por ejemplo, las especies aeróbicas de bacterias y levaduras se pueden encontrar miembros sólo como menores de la microflora en el intestino de abeja [12] , que puede ser baja en la disponibilidad de oxígeno [12] , [13] , pero pueden alcanzar una alta abundancia en el néctar de flores . Estos microbios pueden afectar a las propiedades químicas de néctar y, en consecuencia, su atractivo para los insectos polinizadores [14] - [17] .

Trabajos recientes han sugerido que los efectos del crecimiento microbiano en el néctar de la preferencia de los polinizadores pueden diferir entre las especies microbianas, al menos cuando los abejorros o colibríes son los polinizadores [15] - [17] . Sin embargo, se conoce poco si las abejas se alimentan de preferencias para los microbios específicos en néctar [18] .Como primer paso hacia la respuesta a esta pregunta, se realizó una serie de experimentos de campo en un pequeño apiario en California. Nuestro objetivo era poner a prueba la hipótesis de que el crecimiento microbiano en el néctar afecta la preferencia del néctar de las abejas melíferas, dependiendo de la identidad de la especie de las bacterias y levaduras. Con el fin de probar esta hipótesis, primero se aisló e identificó posibles microbios abeja asociada que fueron capaces de crecer en el néctar y utilizan algunas de estas cepas en los experimentos de campo.

Materiales y Métodos

Sitio de Estudio


El estudio se realizó en las instalaciones de crecimiento de las plantas en el campus de la Universidad de Stanford, ubicada en la península de San Francisco de California. Este sitio tenía un pequeño apiario que consta de aproximadamente 160 colmenas de abejas de miel (Figura 1a ).
Figura 1. Experimentales apiarios y artificiales arreglos florales.

(A) Apiario con una gran variedad de flores artificiales dispuestos en la sombra, 1-2 metros de las colmenas. (B) se destacan flor Experimental en la que las abejas pueden ver alimentándose de las flores contienen néctar sintética inoculada con microbios.Cada tratamiento estuvo representado una vez en cada stand. (C) de flores experimental que muestra una alimentación de abeja de la miel de néctar sintético.
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.g001

Muestreo microbiano en el intestino de la abeja


Para obtener algunas de las cepas microbianas en el intestino de la abeja, se capturaron un total de 150 abejas en el colmenar utilizando contenedores amarillos llenos de agua jabonosa para atrapar abejas vivas. Para el primer experimento de campo (ver el diseño experimentalmás adelante), colocamos 10 contenedores alrededor de las colmenas a las 10:00 AM y se recuperaron 55 abejas vivas atrapadas en los contenedores a las 3:30 pm el 29 de febrero de 2012. Hemos utilizado 50 de los 55 las abejas para la toma de muestras de microbios. Para el segundo y tercer experimentos de campo (véase el diseño experimental más adelante), colocamos 20 contenedores a las 8:00 AM y se recuperaron 80 abejas vivas a las 1:00 PM el 29 de junio de 2012. Además, colocamos 8 contenedores a las 10:30 AM y se recuperaron 60 abejas vivas a las 1:00 PM del 30 de junio de 2012. De los aproximadamente 140 abejas atrapadas en estos dos días, hemos utilizado 100 para el muestreo microbiano.

Inmediatamente después de la eliminación de los contenedores, las abejas vivas se colocaron en un refrigerador a 4 º C durante 3 minutos para frenar el movimiento. Las abejas fueron disecados transversalmente para separar la picadura, abrir el segmento posterior del abdomen y retirar el intestino completamente intacta que contiene el intestino. Dentro del intestino probamos la cosecha, un órgano central en la producción de alimentos de la abeja, que se encuentra entre el esófago y el ventrículo y se utiliza para la recolección y transporte de néctar a la colmena. El contenido de cada cultivo se colocaron a continuación en tres repeticiones de dos tipos de placas (seis placas por muestra gut): (1) agar levadura-malta (LMA; Difco, Sparks, MD, EE.UU.) suplementado con 100 mg / l de ampicilina para prevenir el crecimiento bacteriano, pero permitir el crecimiento de la levadura, y (2) YMA suplementado con 100 mg / l de cicloheximida para prevenir el crecimiento de la levadura, pero permiten el crecimiento bacteriano. Estudios previos utilizaron medios similares para aislar microbios de abeja intestino [19] , [20] .

Las placas se incubaron a 25 ° C durante 3 a 5 días en condiciones aeróbicas. Observamos que las bacterias y levaduras que se encuentran en el intestino abeja de la miel que requieren condiciones anaeróbicas no han sobrevivido en estas condiciones. Las placas no fueron incubadas durante el mismo período de tiempo, debido a la longitud de tiempo requerido para el crecimiento de colonias parecía variable de entre las especies y que estábamos interesados ​​en el aislamiento de múltiples especies. Para cada muestra de intestino, en la mayoría de tres réplicas de las colonias morfológicamente distintos fueron sub-rayada en las placas. Las muestras de todas las abejas se agruparon entonces con el fin de identificar morfotipos de colonias comunes. Hasta tres réplicas de cada morfotipo distinta fueron elegidos para la extracción de ADN y amplificación con el kit de PCR de tejido Sigma RED Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, EE.UU.), que se utilizó de acuerdo con el fabricante de especificaciones. Una porción del gen 16S rRNA para las bacterias y el gen 18S de levaduras fueron amplificados utilizando cebadores bacterianos, U519F y U1099R [21] , y los cebadores fúngicos, NL1 y NL4 [22] . Los amplicones fueron secuenciados por la proteína de la Universidad de Stanford y de las instalaciones de ácido nucleico, usando un ABI-3130 × L Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Las secuencias consenso se agruparon en unidades taxonómicas operacionales (UTO) en base a 98% de similitud, utilizando Geneious Pro (Biomatters Ltd, Auckland, Nueva Zelanda).Consenso de secuencias de cada OTU se identificaron utilizando Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) búsquedas en contra del Centro Nacional de Información Biotecnológica de GenBank. Se recuperó un total de 16 especies (14 bacterianas y fúngicas 2) a partir de los 150 disecciones intestinal ( Tabla 1 , Figura S1 ). De éstos, las cepas de las especies que se encuentran comúnmente se mantuvieron en YMA y recién estrías 2-4 días antes de cada uno de los experimentos de campo se describen a continuación.
Tabla 1. Asignaciones taxonómico de microorganismos aislados de A. melliferaintestino especímenes en este estudio.
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.t001

Experimentales Flores


Para los experimentos en el apiario, fueron hechos a mano 40 flores artificiales. Las flores fueron diseñadas para fomentar las visitas de abejas [23] y consistieron en papel en forma de girasol de color amarillo con una tapa de tubo de centrífuga de 1,5 ml adjunta al centro ( Figura 1b, c ). Nos apegamos a cuatro de las flores para cada uno de 10 palos de bambú pintado verde-usando alambre de floristería y cinta de floristería verde. Los palos eran de aproximadamente 1 m de altura. En el apiario, las 10 gradas tenían 4 flores con cada uno conteniendo uno de los cuatro tratamientos que se detallan a continuación. Los stands se colocaron aproximadamente 1-2 m de distancia de las colmenas ( Figura 1a ).

Diseño Experimental


Uso de las flores artificiales, se llevaron a cabo tres experimentos. En los dos primeros experimentos, cada vial se llenó con 200 l de néctar sintético que había sido inoculado con: (1) no hay bacterias o levaduras (un néctar de control), (2) astilbes Asaías (bacteria Gram negativa), (3) ya sea Erwinia tasmaniensis (bacteria Gram negativa) o Lactobaccillus kunkeei(bacteria Gram positiva), o (4) Metschnikowia reukaufii (levadura). Cuando se prepara el néctar sintética microbio-inoculados, se incubaron todas las preparaciones a 25 º C durante 4 días antes de cada día de cada experimento en esterilizada por filtración, 15% w / v solución de sacarosa suplementado con 0,32 mM de aminoácidos de la caseína digerida. Las concentraciones de sacarosa y de aminoácidos fueron seleccionados con el fin de imitar típica néctar de flores [24] - [26] . Las colonias individuales de las especies apropiadas se diluyeron a continuación hasta 200 células por microlitro de cada día experimental. Aproximadamente 1,5 ml de esta suspensión diluida se añadió a 8 ml de la solución de sacarosa inmediatamente antes del inicio del experimento de campo cada día. Por lo tanto, un suministro fresco de aproximadamente 32 células por solución néctar l se presentó a las abejas cada día de la experimentación. Las densidades celulares de 10 células de levadura por 4 l [27] y 30 UFC (unidades formadoras de colonias bacterianas) por l [17] Se han observado comúnmente en néctar de flores en el campo. El néctar de control se preparó de la misma manera, excepto que no fue inoculado con microbios. En lugar de ello, w / v de solución de sacarosa suplementado con 0,32 mM de aminoácidos de la caseína digerida se añadió 1,5 ml de filtro esterilizado 15%. Añadimos los mismos aminoácidos en todos los tratamientos, incluyendo el control, ya que es bien conocido que el tipo de proteína puede afectar la preferencia de las abejas [28] .

En el primer experimento, llevado a cabo en 13 a 15 abril 2012, A. astilbes y E. tasmaniensisse utilizaron debido a que parecían ser las bacterias cultivables más comunes en el primer conjunto de muestras del intestino de la abeja. En el segundo experimento, llevado a cabo en 6 a 12 septiembre 2012, L. kunkeei se utilizó en lugar de E. tasmaniensis porque L. kunkeeise encontró con mayor frecuencia en el segundo conjunto de muestras intestinales. M. se utilizó reukaufii porque es la especie de levadura de néctar que habitan dominantes en el néctar de flores de muchas especies de plantas [29] - [34] y porque nos encontramos en nuestras muestras intestinales de abeja, así, a pesar de que no está claro si es o no M.reukaufii replica en el intestino.

El tercer experimento, llevado a cabo en 17 a 20 septiembre 2012, era idéntica en diseño a los dos primeros experimentos, excepto que, en lugar de utilizar E. tasmaniensis - o L. néctarinoculado-kunkeei como el tercer grupo de tratamiento, se utilizó el néctar que fue inoculado con A. astilbes como en el segundo grupo de tratamiento, pero esterilizada por filtración (tamaño de poro: 0,2 micras). inmediatamente antes de que el uso experimental A. astilbesson bacilos cortos que miden 0,6 por 1,2 a 2,0 micras [35] . Se utilizó el tratamiento néctar filtrada para determinar si las abejas respondieron a la presencia de A. astilbes en néctar per se o los cambios en las propiedades químicas del néctar causadas por A. astilbes.

Durante cada uno de los tres experimentos, nuevos viales estériles que contienen 200 l de néctar sintética microbio-inoculado fresco fueron utilizados cada día. Se asignaron Los cuatro flores en cada stand al azar a uno de los cuatro grupos de tratamiento cada día. Dos de los soportes 10 se embolsaron con malla (tamaño de malla: 1 mm) para denegar el acceso por las abejas con el fin de dar cuenta de la reducción de peso néctar por evaporación.Aproximadamente dos horas después del inicio del experimento cada día, el néctar restante del vial de cada flor se tapó, se trajo de vuelta al laboratorio, y se pesó usando una microbalanza para estimar cambios en el volumen. Cada día, el experimento comenzó aproximadamente a las 10:00 PM. En los días más cálidos, las abejas visitaron las muestras de néctar con más frecuencia, por lo que recuperar las muestras antes de tener cantidades perceptibles de volumen de néctar para pesar.

Aunque no observamos directamente las flores en el campo durante todo el período experimental de 2 horas cada día, nuestras extensas observaciones indicaron que las abejas eran la principal, si no el único, animales que visitaron las flores ( Figura 1 ). Se realizaron observaciones directas de las flores artificiales durante las primeras 15 a 30 minutos y los últimos 10-15 minutos de cada uno de los períodos experimentales de 2 horas. Motivos logísticos nos impidieron hacer las observaciones directas para todo el período de 2 horas. Los únicos otros visitantes florales que observamos eran chaquetas amarillas (Vespula spp.), Y que rara vez se observa (sólo tres veces durante un experimento de una semana de duración) que visitan las flores artificiales. Además, incluso cuando una chaqueta amarilla se posó en una flor artificial, no se observó ninguno de ellos consume el néctar artificial. Por el contrario, se observaron las abejas de la miel con frecuencia visitar y alojarse en las flores, y era posible ver su trompa en el líquido ( Figura 1 ).

En los tres experimentos, la temperatura ambiente en el momento de la días se llevó a cabo el experimento fue de aproximadamente 16-25 ° C, con poco o ningún viento. El área fue bien la sombra de la ventana experimental 1-2 horas.

Efecto de la inoculación microbiana en Nectar Química


Debido a que los resultados de nuestros experimentos de campo indicaron que las abejas evitarse néctar colonizado-bacterias no a causa de la presencia de las bacterias de por sí, pero debido a los cambios en la química del néctar inducidos por las bacterias ( Figura 2 ), se realizó un experimento adicional en el laboratorio para investigar el efecto de la inoculación microbiana en la química del néctar. Para ello, hemos preparado el néctar sintética microbio inoculado exactamente como lo hicimos para los experimentos de campo, utilizando las mismas cepas de A. astilbes y M. reukaufii como para el experimento principal y una cepa deErwinia sp. que hemos aislado a nivel local a partir del néctar de flores de Mimulus aurantiacus.En este experimento, no usamos la cepa de L. kunkeei o E. tasmaniensis utilizado en el experimento principal, debido a que los cultivos de reserva de estas cepas se habían perdido.Después de la incubación de cuatro días, se midió el pH, H 2 O 2, y sacarosa, glucosa, fructosa y las concentraciones de las muestras incubadas néctar, usando los métodos descritos anteriormente [17] . Nos hemos centrado en estas medidas porque la investigación anterior indicó que los microbios podrían inducir grandes cambios en estas propiedades químicas y que los cambios podrían tener un efecto sobre los visitantes de flores [17] , [36] -[38] . Se utilizaron un total de 20 unidades experimentales, es decir, 4 tratamientos (control, A. astilbes, M. reukaufii y Erwinia sp.) × 5 repeticiones.
Figura 2. Efectos de las inoculaciones microbianas en la remoción de néctar de las abejas melíferas.

(A) Los resultados del experimento 1, que muestran que la remoción de néctar dependía de tratamiento microbiano (Metschnikowia reukaufii, astilbes Asaías o Erwinia tasmaniensis). (B) Los resultados del experimento 2, que muestran que el néctar inoculado con A. astilbes o Lactobacillus kunkeei se retiró menos de néctar inoculado con levadura (M. reukaufii) o microorganismos. (C) Los resultados del experimento 3, que muestran que el néctar inoculado con A. astilbes o inoculado con él y luego esterilizado filtrado se eliminó menos de néctar levaduras inoculadas y control. Las barras indican la media ± 1 SE. Cartas sobre las barras indican tratamientos que difieren significativamente (prueba de Tukey HSD, α = 0,05).
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.g002

Análisis estadístico


La cantidad de néctar eliminado por las abejas de cada vial se estimó como a - b, donde a es el peso (g) del néctar restante en el vial de control de evaporación más el vial de sí mismo después de la exposición a 2-hora en el campo, y b es el peso (g) del néctar restante en el vial focal más el propio vial después de la exposición a 2-hora en el campo. Se evaluaron los efectos de las inoculaciones microbianas en la eliminación néctar utilizando un modelo mixto lineal, con el tratamiento microbiano como efecto fijo y día experimental como un efecto aleatorio, seguido de una prueba de HSD de Tukey para evaluar las diferencias significativas entre los niveles de tratamiento, el uso de paquetes nLME [39 ] y multcomp [40] en R v 2.15.0[41] . Para examinar la variación en los efectos del tratamiento con el tiempo, también realizó análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para cada día, con los tratamientos microbianos como la variable predictora y el néctar eliminado como variable de respuesta utilizando R v 2.15.0 [ 41] . Dentro de cada experimento (experimentos 1 a 3), una corrección secuencial de Bonferroni se utilizó para tener en cuenta múltiples pruebas durante varios días. ANOVA, seguido por una prueba HSD de Tukey, se utilizó para probar el efecto de las especies inoculadas en cada medición química.

Resultados


En las primera y segunda experimentos, de 3 a 31% menos de néctar de las flores se eliminó experimentales cuando se inoculan con A. astilbes, E. tasmaniensis o L. kunkeei que con M.reukaufii o sin microorganismos (experimento 1: El tratamiento de F 3, 90 = 6.97, P <0 a="" href="http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=es&prev=/search%3Fq%3DThe%2Bgut%2Bmicroflora%2Bof%2Bthe%2Bhoney%2Bbee,%2BApis%2Bmellifera,%2Bis%2Breceiving%2Bincreasing%2Battention%2Bas%2Ba%2Bpotential%2Bdeterminant%2Bof%2Bthe%2Bbees%25E2%2580%2599%2Bhealth%2Band%2Btheir%2Befficacy%2Bas%2Bpollinators.%26biw%3D1366%26bih%3D643&rurl=translate.google.com.uy&sl=en&u=http://www.plosone.org/article/info%253Adoi%252F10.1371%252Fjournal.pone.0086494%3Bjsessionid%3DC0178CB814D9114EDE34A46E3203866F&usg=ALkJrhhIzCRbttA0-VDiJ7Zx_lbhIaeVMQ#pone-0086494-g002" style="color: #3c63af; text-decoration: none;">Figura 2a
 ; experimento 2 tratamiento: F 3214 = 20,30, p <0 a="" href="http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=es&prev=/search%3Fq%3DThe%2Bgut%2Bmicroflora%2Bof%2Bthe%2Bhoney%2Bbee,%2BApis%2Bmellifera,%2Bis%2Breceiving%2Bincreasing%2Battention%2Bas%2Ba%2Bpotential%2Bdeterminant%2Bof%2Bthe%2Bbees%25E2%2580%2599%2Bhealth%2Band%2Btheir%2Befficacy%2Bas%2Bpollinators.%26biw%3D1366%26bih%3D643&rurl=translate.google.com.uy&sl=en&u=http://www.plosone.org/article/info%253Adoi%252F10.1371%252Fjournal.pone.0086494%3Bjsessionid%3DC0178CB814D9114EDE34A46E3203866F&usg=ALkJrhhIzCRbttA0-VDiJ7Zx_lbhIaeVMQ#pone-0086494-g002" nbsp="" style="color: #3c63af; text-decoration: none;">Figura 2b ). En ambos experimentos, esta tendencia no fue significativa en los dos primeros días, pero posteriormente se convirtió en significativo ( Figura S2a, b ). Del mismo modo, en el tercer experimento, aproximadamente 32% menos de néctar se eliminó cuando se inoculan con A. astilbes que con M. reukaufii o el control (experimento 3: F 3, 121 = 43,26, P <0 a="" href="http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=es&prev=/search%3Fq%3DThe%2Bgut%2Bmicroflora%2Bof%2Bthe%2Bhoney%2Bbee,%2BApis%2Bmellifera,%2Bis%2Breceiving%2Bincreasing%2Battention%2Bas%2Ba%2Bpotential%2Bdeterminant%2Bof%2Bthe%2Bbees%25E2%2580%2599%2Bhealth%2Band%2Btheir%2Befficacy%2Bas%2Bpollinators.%26biw%3D1366%26bih%3D643&rurl=translate.google.com.uy&sl=en&u=http://www.plosone.org/article/info%253Adoi%252F10.1371%252Fjournal.pone.0086494%3Bjsessionid%3DC0178CB814D9114EDE34A46E3203866F&usg=ALkJrhhIzCRbttA0-VDiJ7Zx_lbhIaeVMQ#pone-0086494-g002" nbsp="" style="color: #3c63af; text-decoration: none;">Figura 2c ). La cantidad de néctar eliminado fue indistinguible entre el tratamiento en el que A. astilbes se inoculó (pero no filtrados) y el tratamiento en el que A. astilbes se inoculó y después se filtró (Figura 2c ). Estas tendencias fueron consistentes a lo largo de la duración del experimento (Figura S2c ).
En el experimento que investigó el efecto de la inoculación microbiana en la química del néctar, las tres especies pH reducido significativamente, y A. astilbes causaron una reducción mayor que M. reukaufii y Erwinia sp. Figura 3a ). No se detectaron diferencias significativas en H 2 O 2 o la concentración de sacarosa entre cualquiera de los tratamientos ( Figura 3b, c ).A. astilbes aumentaron las concentraciones de glucosa y de fructosa, mientras que M.reukaufii y Erwinia sp. no causó cambios detectables ( Figura 3d, e ).
Figura 3. Efectos de inoculaciones microbianas en: (a) pH, (b) H 2 O 2, (c) sacarosa, (d) de glucosa, y (e) las concentraciones de fructosa en néctar.

Bares y cartas son como en la Figura 2 .
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.g003

Discusión


Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan apoyo a la hipótesis de que el crecimiento microbiano en el néctar afecta a la alimentación de preferencia de abejas de la miel, y que el efecto depende de la identidad de las especies microbianas. Específicamente, nuestros datos indican que las abejas prefieren libre de colonias de las tres especies de bacterias aeróbicas que aislamos en el intestino de abeja néctar, mientras que la levadura néctar que habitan en M. reukaufii tuvo ningún efecto sobre la preferencia de alimentación de las abejas. Nuestros datos también indican que la evitación de bacterias colonizadas néctar no fue causada por la presencia de las bacterias por sí misma, sino por los cambios químicos a néctar producidas por la bacteria. En general, este estudio puede sugerir que los microbios intestinales que habitan no sólo afectan a la salud de los A. mellifera como simbiontes, pero potencialmente también influir en su comportamiento de alimentación alterando la química del néctar.

Esperábamos que las abejas prefieren el néctar inoculado con la bacteria debido a que la literatura sugiere que los taxones bacteriana se utilizó podría ser beneficiosa como simbiontes en el intestino de la abeja de la miel [3] , [4] , [7] - [9] , [42] - [44] . Aunque la evidencia para el potencial de E. tasmaniensis a ser un importante simbionte de insectos no es definitiva [45] ,L. kunkeei se ha indicado que es un simbionte mutualista de A. mellifera [46] , y varias especies de Asaia se han indicado como simbiontes dominantes de algunas especies de insectos, por ejemplo, el mosquito Anopheles stephensi [8] , [9] y la titanus Scaphoideussaltahojas [8] , [47] . Secuenciación molecular indicó que A. astilbes y L. kunkeei son relativamente estrechamente relacionados con uno de los grupos de las bacterias supuestos dominantes (el Alfa-2.2 filotipo y la Firma-4 filotipo, respectivamente) en el intestino de la abeja[43] , pero ninguna de nuestras cepas bacterianas fueron anidados filogenéticamente en cualquiera de estos grupos ( Figura S1 ). Incluso si nuestras cepas bacterianas no son numéricamente dominantes en el intestino de la abeja, esto puede no indica necesariamente que sean funcionalmente irrelevante como simbiontes, o como nuestros resultados sugieren ahora, como modificadores de abeja comportamiento de alimentación.

Los resultados del experimento que investigó el efecto de la inoculación microbiana en la química del néctar sugieren que los cambios en cualquiera de néctar de pH o concentración de glucosa o fructosa podrían ser una razón por qué las abejas pueden evitar que las bacterias inoculadas néctar. Sin embargo, aunque A. astilbes y Erwinia sp. afectado a la química del néctar de manera diferente ( Figura 3 ), esta diferencia no parece afectar la eliminación de néctar de las abejas ( Figura 2 ). Por otra parte, se ha indicado que las abejas prefieren sacarosa sobre la glucosa o fructosa cuando cada uno se ofrece como un solo azúcar [48] , por lo que el aumento de la glucosa y la fructosa puede que no sea una explicación plausible de las opciones de comportamiento. Además, es intrigante que los cambios medidos en las propiedades de néctar en el M. reukaufii y Erwinia sp. tratamientos fueron similares, sin embargo M. reukaufii no afectó forrajeo mientras que Erwinia hizo. Una posible explicación de este contraste es que la Erwinia sp. utilizado en el experimento para probar el efecto sobre las propiedades de néctar fue funcionalmente diferente de la E. tasmaniensis utilizado en el experimento de campo en la preferencia de abeja. Otra posibilidad es que M. reukaufii yErwinia spp. tenido efectos diferentes en algunos aspectos importantes de la química del néctar que no nos medimos. Por ejemplo, las especies pueden haber diferido en su capacidad para producir etanol. Etanol producido por microorganismos en el néctar se ha sugerido para alterar de forrajeo de néctar por los insectos, por ejemplo, avispas consumir orquídea néctar[14] . También es posible que otros compuestos orgánicos volátiles podrían desempeñar un papel [48] , pero las pruebas estas posibilidades requerirían experimentos adicionales.

La capacidad de A. astilbes para aumentar los niveles de glucosa y de fructosa sin reducir sacarosa pueden parecer desconcertante ( Figura 3 ). Es probable, sin embargo, que la reducción en la concentración de sacarosa que condujo al aumento de la concentración de glucosa y la fructosa era demasiado pequeño para ser detectado en contra de la variación inicial que existía entre las réplicas en tratamientos. En contraste, en glucosa y fructosa, un aumento de una magnitud similar podría ser detectada con mayor potencia estadística debido a la variación inicial de la glucosa y la fructosa era esencialmente inexistente; hubo inicialmente sin glucosa o fructosa en nuestra néctar artificial.

Microbiota intestinal son diversas, que contiene muchas más especies que los cuatro nos centramos en este estudio [43] . Nuestro propósito no era caracterizar la comunidad microbiana del intestino, sino que nos centramos en las cepas bacterianas y de levaduras seleccionadas se encuentran tanto en el intestino de las abejas y el néctar floral. Nuestros resultados sugieren que puede ser útil para investigar los efectos de una mayor variedad de especies para evaluar la generalidad de nuestros resultados. Muchos, aunque probablemente no todas, de otras especies simbióticas tubo digestivo puede ser capaz de crecer en néctar.Sería interesante utilizar diferentes condiciones de cultivo, incluyendo aquellos que involucran O bajado 2 niveles [49] , [50] , para aislar las diferentes cepas, incluidas las que pertenecen a los grupos dominantes de la microflora intestinal identificados por estudios recientes [43 ] ,[51] - [53] , y repita la abeja de forrajeo experimento preferencia. Vale la pena señalar, sin embargo, que más de oxígeno que normalmente pueden estar disponibles en el néctar que en el intestino. Por lo tanto, es posible que sólo un subconjunto, en su caso, de las bacterias que requieren bajo niveles de O 2 para el crecimiento puede reproducir en néctar a un grado suficiente para tener un gran efecto sobre las abejas. Además de la realización de pruebas de comportamiento utilizando inoculaciones de especies únicas de especies microbianas adicionales, el establecimiento de inoculaciones múltiples especies sería interesante como el néctar de flores es a menudo probable que contenga más de una especie. Este tipo de trabajo avanzará aún más nuestra comprensión de los efectos de los microbios intestinales en el néctar de las opciones de forrajeo de las abejas.

Si las bacterias néctar colonizar influyen visitas de flores por las abejas de miel, su comportamiento de forrajeo alterado puede tener consecuencias para la polinización. Aunque hemos utilizado una mezcla realista de azúcares y aminoácidos en el néctar de síntesis, los estudios futuros podrían utilizar las flores de verdad para confirmar la relevancia de nuestros hallazgos a la polinización por las abejas. En este contexto, el contraste en respuesta conductual que encontramos entre el efecto negativo de la colonización bacteriana de néctar y el efecto neutro de la colonización néctar de levadura es especialmente intrigante. M. reukaufii, que es la especie más dominante de la levadura en el néctar en nuestra región de estudio[31] y muchos otros lugares en todo el mundo [29] , [30] , [32] - [34] , se ha demostrado que crecer rápidamente y alcanzar un alto densidad en néctar, posteriormente cambiando las propiedades químicas de néctar considerablemente [17] , [54] , [55] . Aun así, esta especie no parece afectar de forrajeo de abeja, mientras que las bacterias que estudiamos lo hicieron.Este hallazgo es consistente con nuestro trabajo reciente sobre el consumo de néctar por colibríes, en la que nos encontramos que el néctar de forrajeo de las aves se ha reducido como consecuencia de la colonización de néctar por una bacteria ( Gluconobacter sp.), pero no porM. reukaufii [17] . En conjunto, nuestros resultados ponen de relieve la importancia de estudiar los efectos de la colonización microbiana especies específicas con el fin de comprender sus efectos potenciales sobre la búsqueda de alimento de las abejas y la polinización.

Información de Apoyo

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Las relaciones filogenéticas, basadas en secuencias bacterianas 16S rRNA, de las especies bacterianas utilizadas en nuestro experimento y las incluidas en las figuras S3B, E y F de Martinson et al. (2011).


Las relaciones filogenéticas, basadas en secuencias bacterianas 16S rRNA, de las especies bacterianas utilizadas en nuestro experimento y las incluidas en las figuras S3B, E y F de Martinson et al. (2011).
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.s001

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Cambios en el día de experimentación en la cantidad de néctar removidos.
doi: 10.1371/journal.pone.0086494.s002

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Agradecimientos


Agradecemos Waldan Kwong para obtener información sobre los métodos de cultivo, Melinda Belisle, Ray Von Itter, y Dave Wilson para el campo y la asistencia de laboratorio, y Rodolfo Dirzo, Sharon Long, Nigel Raine, Erin Jo Tiedeken, y los miembros del grupo de ecología de comunidades en Stanford Universidad de los comentarios sobre los borradores del manuscrito.

Contribuciones de autor

Concebido y diseñado los experimentos: APG MPLG FT. Realizado los experimentos: APG MPLG RLV. Analizados los datos: APG RLV. Herramientas reactivos Contribuido / materiales / análisis: APG MPLG RLV TF. Escribió el documento: APG TF. Revisado el manuscrito: APG MPLG RLV TF.

Referencias

  1. 1.Consejo Nacional de Investigación de las Academias Nacionales (2007) Estado de los polinizadores en América del Norte. Washington, DC: National Academies Press. 312 p.
  2. 2.Evans JD, Aronstein K, Chen YP, Hetru C, Imler JL, et al. (2006) las vías inmunológicas y mecanismos de defensa de las abejas melíferas Apis mellifera .Insect Molecular Biology 15: 645-656. doi: 10.1111/j.1365-2583.2006.00682.x
  3. 3.Dillon RJ, Dillon VM (2004) Las bacterias del intestino de los insectos: las interacciones patógenas. Revisión Anual de Entomología 49: 71-92. doi: 10.1146/annurev.ento.49.061802.123416
  4. 4.Gilliam M (1997) Identificación y funciones de la microflora no patógena asociados a las abejas de miel. FEMS Microbiology Letters 155: 1-10. doi: 10.1016/s0378-1097 (97) 00337-6
  5. 5.VanEngelsdorp D, Underwood R, Caron D, Hayes J Jr (2007) Una estimación de las pérdidas de colonias administradas en el invierno de 2006-2007: un informe encargado por los Inspectores Apícolas de América. American Bee Journal 147: 599-603.
  6. 6.Moran NA, Hansen AK, Powell JE, Sabree ZL (2012) Distintivo microbiota intestinal de las abejas melíferas evaluó a través de un muestreo de profundidad de las abejas obreras individuales. PLoS One 7: e36393. doi: 10.1371/journal.pone.0036393
  7. 7.Vásquez A, Forsgren E, Fries I, Paxton RJ, Flaberg E, et al. (2012) simbiontes como principales moduladores de la salud de insectos: bacterias lácticas y las abejas. PLoS One 7: e33188. doi: 10.1371/journal.pone.0033188
  8. 8.Crotti E, Damiani C, Pajoro M, Gonella E, Rizzi A, et al. (2009) Asaia, un simbionte ácido acético versátil bacteriana, capaz de trans-colonizadoras insectos de los géneros y órdenes filogenéticamente distantes. Environmental Microbiology 11: 3252-3264. doi: 10.1111/j.1462-2920.2009.02048.x
  9. 9.Crotti E, Rizzi A, B Chouaia, Ricci I, Favia G, et al. (2010) las bacterias del ácido acético, simbiontes reciente aparición de insectos. Applied and Environmental Microbiology 76: 6.963-6.970. doi: 10.1128/aem.01336-10
  10. 10.Lambert B, Kersters K, Gossele F, J Swings, Deley J (1981) Gluconobacters de las abejas de miel. Antonie Van Leeuwenhoek Journal of Microbiology 47: 147-157. doi: 10.1007/bf02342197
  11. 11.Lambert B, Kersters K, Gossele F, J Swings, De Ley J (1981) Gluconobacter spp. de las abejas de miel. Journal of Microbiology 47: 147-158. doi: 10.1007/bf02342197
  12. 12.Engel P, James R, Koga R, Kwong WK, McFrederick Q, et al .. (2013) Los métodos estándar para la investigación sobre Apis mellifera simbiontes intestinales. En: Dietemann V, Ellis JD Neumann P, editores. El Coloss BEEBOOK, Volumen I: métodos estándar para la investigación Apis mellifera. Revista de Investigaciones Apícolas 52 (4): http://dx.doi.org/10.3896/IBRA.1.52.4.07
  13. 13.Mattila HR, Ríos D, Walker-Sperling VE, Roeselers G, Newton ILG (2012) Caracterización de los microorganismos involucrados activos asociados con abejas melíferas revela comunidades más sanas y más amplios cuando las colonias son genéticamente diversas. PLoS One 7: e32962. doi: 10.1371/journal.pone.0032962
  14. 14.Ehlers BK, Olesen JM (1997) La ruta de frutas avispa de néctar tóxico en orquídeasEpipactis? Fauna 192: 223-229.
  15. 15.Herrera CM, Pozo MI, Medrano M (2013) Las levaduras en el néctar de una hierba-florecimiento temprano: buscan los abejorros, perjudiciales para plantar la fecundidad.Ecology 94: 273-279. doi: 10.1890/12-0595.1
  16. 16.Pozo MI (2013) Las levaduras en el néctar de flores: la ecología y las interacciones con los insectos polinizadores y plantas huéspedes de la comunidad. Tesis doctoral.Estación Biológica de Doñana, Sevilla, España.
  17. 17.Vannette RL, Gauthier M-PL, Fukami T (2013) las bacterias de néctar, pero no de la levadura, debilitan la planta - polinizador mutualismo. Actas de la Sociedad Real de Ciencias Biológicas B-280: 20122601. doi: 10.1098/rspb.2012.2601
  18. 18.Kevan PG, Eisikowitch D, Fowle S, Thomas K (1988) Levadura néctar contaminado y sus efectos en la búsqueda de alimento de las abejas. Revista de Investigaciones Apícolas 27: 26-29.
  19. 19.Basukriadi A, Sjamsuridzal W, Putra BB (2010) Identificación molecular y diversidad de levaduras provenientes de Apis cerana alimentándose de flores de Jatropha integerrima. Microbiología Indonesia 4: 44-48. doi: 10.5454/mi.4.1.9
  20. 20.Stefanini I, Dapporto L, J Legras, Calabretta A, Di Paola M, et al. (2012) El papel de las avispas sociales en Saccharomyces cerevisiae ecología y evolución. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 109: 13398 a 13.403. doi: 10.1073/pnas.1208362109
  21. 21.Wang Y, Qian PY (2009) fragmentos conservadores en bacterianos 16S rRNA genes y el diseño del cebador de ADN amplificados 16S ribosomal en estudios de metagenómica. PLoS One 4: E7401. doi: 10.1371/journal.pone.0007401
  22. 22.Kurtzman CP, Robnett CJ (1998) Identificación y filogenia de las levaduras ascomycetous de análisis de la subunidad grande (26S) nuclear secuencias parciales de ADN ribosomal. Antonie Van Leeuwenhoek Internacional Journal of General y Microbiología Molecular 73: 331-371.
  23. 23.Gould JL, Gould CG (1988) La abeja de la miel. Nueva York: Scientific American Library 239 p.
  24. 24.Panadero HG, Baker I (1973) Los aminoácidos en el néctar y su significado evolutivo.Naturaleza 241: 543-545. doi: 10.1038/241543b0
  25. 25.Perret M, Chautems A, Spichiger R, Peixoto M, Savolainen V (2001) composición de azúcares Nectar en relación con los síndromes de polinización en Sinningieae (Gesneriaceae). Annals of Botany 87: 267-273.
  26. 26.Chalcoff VR, Aizen MA, Galetto L (2006) Concentración Nectar y la composición de 26 especies de los bosques templados de América del Sur. Annals of Botany 97: 413-421.
  27. 27.Herrera CM, de Vega C, Canto A, Pozo MI (2009) Las levaduras en el néctar floral: un estudio cuantitativo. Annals of Botany 103: 1415-1423.
  28. 28.Altaye SZ, Pirk CWW, Crewe RM, Nicolson SW (2010) La convergencia de los objetivos de la ingesta de hidratos de carbono-un sesgo en las abejas obreras enjaulados alimentados con diferentes fuentes de proteínas. Journal of Experimental Biología 213: desde 3311 hasta 3318. doi: 10.1242/jeb.046953
  29. 29.Brysch-Herzberg M (2004) Ecología de las levaduras en el mutualismo planta-abejorro en Europa Central. FEMS Microbiology Ecology 50: 87-100. doi: 10.1016/j.femsec.2004.06.003
  30. 30.Herrera CM, Canto A, Pozo MI, Bazaga P (2010) dulzura Inhospitable: Filtrado de néctar de inóculos polinizador transmitidas conduce a las comunidades empobrecidas de levadura, filogenéticamente agrupados. Actas de la Sociedad Real de Ciencias Biológicas B-277: 747-754. doi: 10.1098/rspb.2009.1485
  31. 31.Belisle M, Peay KG, Fukami T (2012) Flores como islas: distribución espacial de microhongos néctar que habitan entre las plantas de aurantiacus de Mimulus , un arbusto colibrí de polinización. Ecología Microbiana 63: 711-718. doi: 10.1007/s00248-011-9975-8
  32. 32.Lachance MA, Starmer WT, Rosa CA, JM Bowles, Barker JSF, et al. (2001) Biogeografía de las levaduras de flores efímeras y sus insectos. FEMS Yeast Research 1: 1-8. doi: 10.1016/s1567-1356 (00) 00003-9
  33. 33.Pozo MI, Herrera CM, Bazaga P (2011) La riqueza de especies de las comunidades de la levadura en el néctar floral de las plantas del sur de España. Ecología Microbiana 61: 82-91. doi: 10.1007/s00248-010-9682-x
  34. 34.Herrera CM, de Vega C, Canto A, Pozo MI (2009) Las levaduras en el néctar floral: un estudio cuantitativo. Annals of Botany 103: 1415-1423.
  35. 35.Suzuki R, Zhang Y, Iino T, Kosako Y, Komagata K, et al. (2010) astilbes Asaías nov sp., Asaia Platycodi sp noviembre, y Asaia prunellae sp noviembre, nuevas bacterias del ácido acético aislados de flores en el Japón. Revista de Microbiología General y Aplicada 56: 339-346. doi: 10.2323/jgam.56.339
  36. 36.Olesen JM, Ronsted N, Tolderlund U, Cornett C, Molgaard P, et al. (1998) néctar rojo Mauricio sigue siendo un misterio. Nature 393: 529-529. doi: 10.1038/31128
  37. 37.Carter C, Thornburg RW (2004) Es el ciclo redox néctar floral defensa contra el ataque microbiano? Tendencias en Plant Science 9: 320-324. doi: 10.1016/j.tplants.2004.05.008
  38. 38.Thornburg RW, Carter C, Powell A, Mittler R, Rizhsky L, et al. (2003) Una de las principales funciones del tabaco nectario floral es la defensa contra el ataque microbiano. Sistemática y Evolución de Plantas 238: 211-218.
  39. 39.Pinheiro J, D Bates, debroy S, D Sarkar (2012) nlme: modelos de efectos mixtos lineales y nonlinaer. R paquete de la versión 3,1 a 103.
  40. 40.Hothorn T, Bretz F, Westfall P (2008) inferencia simultánea en modelos paramétricos generales. Biométrico Diario 50: 346-363. doi: 10.1002/bimj.200810425
  41. 41.R Development Team Core (2012) R: Un lenguaje y un entorno para el cálculo estadístico. Viena, Austria.
  42. 42.Loncaric I, Ruppitsch W, Licek E, Moosbeckhofer R, Busse HJ, et al. (2011) Caracterización de bacterias no fermentadoras Gram-negativos seleccionados aislados de las abejas melíferas ( Apis mellifera carnica ). Apidologie 42: 312-325.
  43. 43.Martinson VG, Danforth BN, Minckley RL, Rueppell O, Tingek S, et al. (2011) Un microbiota simple y distintivo asociado con las abejas y abejorros. Molecular Ecology 20: 619-628. doi: 10.1111/j.1365-294x.2010.04959.x
  44. 44.Parker R, Melathopoulos AP, Blanco R, Pernal SF, Guarna MM, et al. (2010) Adaptación ecológica de los diversos abeja de la miel ( Apis mellifera ) poblaciones.PLoS One 5: e11096. doi: 10.1371/journal.pone.0011096
  45. 45.Palacio-Bielsa A, Rosello M, Llop P, López MM (2012) Erwinia spp. de los árboles frutales de pepita: similitudes y diferencias entre las especies patógenas y no patógenas. Árboles - Estructura y Función 26: 13-29. doi: 10.1007/s00468-011-0644-9
  46. 46.Rangberg A, Diep DB, Rudi K, Amdam GV (2012) paratransgenesis: un enfoque para mejorar la salud de la colonia y la visión molecular en las abejas melíferas ( Apis mellifera )? Integrativa y Comparado Biología 52: 89-99. doi: 10.1093/icb/ics089
  47. 47.Marzorati M, Alma A, Sacchi L, M Pajoro, Palermo S, et al. (2006) Una novela Bacteroidetes simbionte se localiza en titanus Scaphoideus , el insecto vector de doree flavescence en Vitis vinifera . Applied and Environmental Microbiology 72: 1467-1475. doi: 10.1128/aem.72.2.1467-1475.2006
  48. 48.Nicolson SW (2007) los consumidores de néctar. En: Nicolson SW, editor. Nectarios y Néctar: ​​Dordrecht: Springer. 289-342.
  49. 49.Kwong WK, Moran NA (2013) El cultivo y caracterización de los simbiontes intestinales de las abejas melíferas y los abejorros: Descripción de Snodgrassella Alvigen. noviembre, sp.nov, un miembro de la. Neisseriaceae familia delBetaproteobacteria y Gilliamella apicola gen. noviembre, sp.noviembre, un miembro deOrbaceae fam. noviembre, Orbales ord. noviembre, un taxón hermano a laEnterobacteriales orden del Gammaproteobacteria . Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva 63: 2008-2018. doi: 10.1099/ijs.0.044875-0
  50. 50.Engel P, Kwong WK, Moran NA (2013) Frischella perrara gen. noviembre, sp.noviembre, un gammaproteobacterium aislado del intestino de la abeja de miel, Apis mellifera . Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva 63: desde 3646 hasta 3651. doi: 10.1099/ijs.0.049569-0
  51. 51.Sabree ZL, Hansen AK, Moran NA (2012) Los estudios independientes utilizando secuenciación profunda resuelven el mismo conjunto de especies bacterianas esenciales que dominan las comunidades intestinal de las abejas de miel. PLoS One 7: e41250. doi: 10.1371/journal.pone.0041250
  52. 52.Cox-Foster DL, Conlan S, Holmes CE, Palacios G, Evans JD, et al. (2007) Una encuesta metagenómica de microbios en la miel de abeja trastorno del colapso de colonias. Ciencia 318: 283-287. doi: 10.1126/science.1146498
  53. 53.Engel P, Martinson VG, Moran NA (2012) Diversidad funcional dentro de la sencilla microbiota intestinal de la abeja de la miel. Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 109: 11.002 a 11.007. doi: 10.1073/pnas.1202970109
  54. 54.Peay KG, M Belisle, Fukami T (2012) relación filogenética predice efectos prioritarios en las comunidades de levadura néctar. Actas de la Sociedad Real de Ciencias Biológicas B-279: 749-758. doi: 10.1098/rspb.2011.1230
  55. 55.Vannette RL, Fukami T (2014) la contingencia histórica en las interacciones entre especies: hacia predicciones basadas en nichos. Ecology Letters 17: 115-124. doi: 10.1111/ele.12204



    SI NO ACTUAMOS MORIREMOS MUCHOS EN LA RULETA GENETICA