- Publicado: 9 de octubre de 2018
- https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205074
Resumen
Cifras
| Table 1. Variability among honey bee colonies in GLY effects. |
Introducción
La polinización mediada por las abejas es un importante servicio agrícola para la producción de alimentos y el mantenimiento de la biodiversidad vegetal [ 1 ]. La abeja melífera ( Apis mellifera L.) es el principal polinizador de insectos en entornos agrícolas [ 2 ]. Sin embargo, la perturbación creciente del ecosistema agrícola afecta negativamente la salud de las abejas melíferas debido a la adaptación crónica a los desafíos ambientales. La homeostasis y la inmunidad óptimas dependen de una nutrición adecuada y una baja carga alostática con el tiempo [ 3 - 5 ]. La disminución de la población de abejas melíferas se considera consecuencia de múltiples factores, como la exposición a agroquímicos, patógenos, parásitos, condiciones climáticas extremas y malas prácticas de apicultura [ 6]., 7 ]. Una sobrecarga de mecanismos compensatorios individuales o sociales por factores estresantes concomitantes puede provocar síntomas subletales o una mayor mortalidad [ 8 ].
Desde finales de la década de 1990, ha habido una expansión rápida y constante de las áreas cultivadas utilizando organismos transgénicos en muchos países [ 9 , 10 ]. El glifosato [N- (fosfonometil) glicina o GLY] es un herbicida de bajo costo y amplio espectro que se utiliza cada vez más en cultivos tolerantes a herbicidas [ 11 , 12 ]. Hoy en día, GLY es el agroquímico más ampliamente aplicado y se ha detectado no solo en tejidos de cultivos genéticamente modificados (GMC) sino también en cultivos tradicionales y malezas resistentes [ 13 - 15 ]. En consecuencia, las colonias de abejas ubicadas cerca de los cultivos están cada vez más expuestas a este herbicida [ 16 - 18] Como resultado, se han detectado trazas de GLY en hasta el 70% de las muestras de miel de países donde se permiten GMC [ 19 ]. GLY incluso se ha detectado en muestras de miel orgánica [ 19 ]. Esto indica la exposición accidental a la que están sometidas las abejas, presumiblemente debido a su amplio rango de alimentación [ 20 , 21 ]. Aunque se han detectado otros pesticidas en los alimentos de cría, como la jalea real, no hay datos disponibles que muestren la presencia de GLY en este producto de colmena [ 22 ].
Recientemente, se han informado efectos adversos subletales en abejas melíferas trabajadoras adultas alimentadas con alimentos que contienen concentraciones de GLY alrededor de 2.8 mg de ácido equivalente (ae) L -1 , la concentración de herbicida más alta registrada en entornos agrícolas [ 23 - 25 ]. Estos ensayos mostraron un deterioro del aprendizaje asociativo y una menor sensibilidad a la sacarosa en las abejas adultas jóvenes cuando se criaron en el laboratorio bajo exposición crónica a GLY [ 26 , 27 ]. Las abejas melíferas expulsoras expuestas a dosis agudas de GLY mostraron capacidades cognitivas debilitadas necesarias para recuperar e integrar información para una alimentación exitosa [ 26 , 28 ].
Estudios anteriores han demostrado efectos perjudiciales de GLY en el desarrollo y crecimiento de una amplia variedad de animales, incluidos los artrópodos [ 29 - 31 ]. Las abejas melíferas son insectos holometabólicos que tienen cuatro mohos que permiten su crecimiento durante el período de alimentación de las larvas [ 32 ]. Cada muda normalmente ocurre aproximadamente cada 24 horas. Durante este período, las larvas se alimentan mientras que las abejas nodrizas las cuidan antes de sellar las células para la pupación (120 horas después de la eclosión) [ 33 , 34] El desarrollo tardío de las larvas, es decir, cuando las larvas tienen una muda sin éxito en un día determinado y muestran un estadio más temprano de lo esperado, se ha demostrado en panales de cría de colmenas ubicadas en los alrededores de cultivos con altos niveles de contaminación por pesticidas, por ejemplo, neonicotinoides, piretroides y carbamatos [ 35 ] GLY no fue monitoreado. Bajo condiciones de semi-campo, las colonias ubicadas cerca de vegetación resistente rociada con 2.88 kg ae ha -1 de GLY presentaron rastros del herbicida de hasta 1.3 mg ae kg -1 en miel y hasta 629 mg ae kg -1 en polen de abeja cestas Además, se detectaron trazas de GLY de 1.23 a 19.5 mg ae kg -1 en muestras de cría [ 36] Aunque este estudio mostró que las larvas pueden recibir alimentos que contienen GLY, no encontró efectos notables en su supervivencia y desarrollo. Sin embargo, la administración indirecta de GLY a la cría a través de la lactancia de las abejas obreras hace que las condiciones de exposición entre las larvas sean complejas y heterogéneas. Además, las abejas muestran variabilidad entre las colonias en cuanto a susceptibilidad a enfermedades [ 37 , 38 ] y pesticidas [ 39 , 40 ] debido a las diferencias en nutrición [ 3 ] y diversidad genética [ 41 - 43 ]. Tanto la inmunidad individual como la social determinan la susceptibilidad de cada abeja y su colonia.
Para determinar los efectos de la ingestión de alimentos contaminados con GLY en la cría de abejas melíferas, expusimos las larvas mediante una administración directa controlada. Llevamos a cabo una cría in vitro [ 44 ] con diferentes concentraciones de GLY contenidas en los alimentos larvales, en el supuesto de un peor escenario de exposición, evaluando los efectos de desarrollo en cada larva durante el período de muda cuando la célula de cría todavía estaba sin sellar (120 horas post-eclosión) [ 32 , 45 ]. Criamos larvas in vitrode 6 colonias diferentes en condiciones homogeneizadas y observaron el efecto de la diversidad genética en la susceptibilidad al GLY de larvas sin inmunidad social. Finalmente, evaluamos los cambios cualitativos en la expresión de genes vinculados a la desintoxicación y la salud en el intestino [ 46 - 49 ], que actúa como la primera barrera para los xenobióticos, como parámetros de salud y capacidad de respuesta a la GLY.
Resultados
Cambios en el desarrollo larvario de las abejas expuestas a GLY
Para detectar cambios en el desarrollo larvario de las abejas melíferas asociadas con la exposición crónica a GLY (para detalles sobre la exposición, ver la Tabla S1 ), cuantificamos la supervivencia y la muda exitosa durante el período de alimentación larval (es decir, durante las primeras 120 horas después de la eclosión, S1 Fig. ) Debido a la posibilidad de variación entre las larvas de diferentes colonias de origen en respuesta al herbicida, tomamos muestras de crías de 6 colonias (AF) para criarlas en condiciones in vitro .
La edad media de muerte de todas las larvas en el grupo de control fue de 92.9 ± 34 h, alrededor de la última muda antes del quinto estadio. Para las larvas expuestas a GLY, la edad media de muerte fue similar, 92.2-106.6 h. Sin embargo, nuestros resultados muestran efectos sobre la proporción de supervivencia con una interacción significativa entre la colonia fuente de cada larva y la concentración de GLY administrada (modelo ATF: prop. Supervivencia ~ [GLY] + colonia + [GLY] × colonia, χ 2 (23) = 344.63, P <0 .001="" n="3062, </font">se realizaron comparaciones por pares post-hoc con la prueba de log-rank, Tabla S2 ). Por lo tanto, GLY afecta la supervivencia de las larvas con diferentes patrones de dosis-respuesta entre las colonias ( Fig. 1) Las colonias B, D y E no mostraron un efecto adverso sobre la supervivencia, mientras que el resto de las colonias mostraron una supervivencia significativamente menor después de la exposición a GLY (20-66% menos de la línea de base, Tabla 1 ). Sin embargo, en las colonias C y E, algunas concentraciones de GLY aumentaron la supervivencia (22-39% más de la línea de base, Tabla 1 ). También encontramos que la línea de base de la proporción de supervivencia fue significativamente diferente entre las colonias bajo cría in vitro , cuando comparamos las curvas de control de supervivencia ( Tabla 1 y Tabla S3 ).
Fig. 1. Supervivencia larval bajo exposición crónica al glifosato para diferentes colonias de abejas melíferas.
Proporción de supervivencia larval durante la exposición (5 días después de la eclosión) a alimentos contaminados con GLY (rango de concentraciones evaluadas: 1.25–5.0 mg por litro). Las curvas de supervivencia se trazan con su intervalo de confianza (95%) para cada tratamiento de larvas criadas in vitro y para cada colonia individual (FA). El número de larvas evaluadas se muestra en el gráfico. Ajuste de datos al modelo AFT (prop. Supervivencia ~ [GLY] + colonia + [GLY] × colonia) seguido de una prueba de Log-rank para comparaciones post hoc de efectos simples. Las curvas se trazan con diferentes colores por tratamiento: in vitrocontrol en azul y un gradiente amarillo-rojo para aumentar los tratamientos de concentración de GLY. El + indica puntos de tiempo con datos de censura. Diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos en cada colonia ( Tabla S2 ).
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El proceso de desarrollo puede tener efectos adversos subletales como la muda tardía. La edad media de retraso para las larvas del grupo control fue de 65.8 ± 35 h. Esto es consistente con el cambio de dieta dentro de la colmena de gelatina de trabajador a pan de abeja. La edad media de retraso para las larvas tratadas con GLY fue similar, 60.7-68.2 h. Nuevamente, nuestros resultados muestran una interacción significativa entre la colonia fuente de cada larva y la concentración de GLY administrada (modelo ATF: prop. De muda exitosa ~ [GLY] + colonia + [GLY] × colonia. Χ 2 (23) = 409.2, P <0 n="3062, </font">se realizaron comparaciones por pares post-hoc con la prueba de log-rank, tabla S2 ). Por lo tanto, GLY afecta el desarrollo larvario con diferentes patrones de dosis-respuesta entre colonias ( Fig. 2) Durante la cría in vitro, varias larvas no expuestas (22-46%) mostraron retraso en el proceso de muda con variabilidad entre las colonias ( Tabla 1 y Tabla S3 ). Bajo exposición a GLY, todas las colonias, excepto B y E, mostraron un aumento en la proporción de larvas con muda tardía (52-184% más de la línea de base, Tabla 1 ). Solo una concentración en la colonia F mostró un retraso reducido en el desarrollo (46% menos de la línea de base, Tabla 1 ). La misma proporción de larvas mostró un doble efecto (es decir, muda tardía seguida de muerte) independientemente de la concentración de GLY (33% para el grupo control y 26-38% para los grupos expuestos a GLY).
Fig. 2. Larva muda bajo exposición crónica al glifosato para diferentes colonias de abejas melíferas.
Proporción de larvas sin demora en la muda por cada día durante la exposición (5 días después de la eclosión) a alimentos contaminados con GLY (rango de concentraciones evaluadas: 1.25–5.0 mg por litro). Las curvas de muda exitosa se trazan con su intervalo de confianza (95%) para cada tratamiento de larvas criadas in vitro y para cada colonia individual (FA). El número de larvas evaluadas para cada tratamiento se muestra en el gráfico. Ajuste de datos al modelo AFT (prop. De muda exitosa ~ [GLY] + colonia + [GLY] × colonia) seguido de una prueba de Log-rank para comparaciones post hoc de efectos simples. Las curvas se trazan con diferentes colores por tratamiento: azul para in vitrocontrol y un gradiente amarillo-rojo para aumentar la concentración de GLY. El + indica puntos de tiempo con datos de censura. Diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos en cada colonia ( Tabla S2 ).
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Los efectos sobre la supervivencia y el desarrollo han demostrado una relación dosis-respuesta no monotónica con efectos positivos en ciertos casos. La concentración más baja de GLY indujo efectos adversos subletales tempranos en algunas colonias (C y D) después de 72 h, mientras que las concentraciones de exposición de 2.5 y 5.0 mg L -1 indujeron efectos subletales y letales en varias colonias (A, C, D y F) . Este patrón podría ser consecuencia de un umbral de respuesta en el proceso de desintoxicación. En consecuencia, al final del período de exposición evaluado (120 h), las larvas expuestas a 1,25 mg L -1 de GLY alcanzaron dosis de alrededor de 100 ng de GLY por larva. Mientras tanto, las larvas expuestas a 2.5 y 5 mg L -1 de GLY alcanzaron esa dosis dentro de las 72 h de exposición ( Tabla S1 ).
Cambios en el crecimiento después de la exposición a GLY
Como la exposición a GLY condujo principalmente a efectos adversos en el desarrollo, deseamos investigar qué efecto podría tener sobre el crecimiento de esas larvas de 5 días que aceptaron la cantidad total de alimentos contaminados (la misma nutrición y dosis) sin síntomas adversos notables. Para evaluar esto, medimos el diámetro y el peso de la cabeza en larvas de tres colonias (DF). Dadas las diferencias en las condiciones de cría y la nutrición, también comparamos el crecimiento de larvas de la misma cohorte entre contextos de cría (en colmena e in vitro , Fig . S2 ).
Se detectaron diferencias no significativas en el diámetro de la cabeza de las larvas muestreadas entre las concentraciones de GLY (prueba de Kruskal Wallis: diámetro de la cabeza ~ tratamiento. Tratamiento como una combinación de [GLY] y colonia, χ 2 (11) = 19.74, P = 0.05; prueba de Nemenyi , df = (12, 108), no hay comparaciones post hoc múltiples significativas , Fig. 3A , Tablas S4 y S5 ). Por lo tanto, estas larvas estaban en la misma etapa de crecimiento asociada con el quinto estadio que otros estudios informaron anteriormente [ 33 , 34] Sin embargo, tanto la colonia fuente como la exposición GLY explican diferencias significativas en el peso con una interacción significativa (modelo GLM: peso ~ [GLY] + colonia + [GLY] × colonia. F (1,108) = 20.54, P <0 .001="" n="120, </font">Se realizaron comparaciones por pares post-hoc con la prueba de Tukey, ver Fig. 3B , Tablas S6 y S7 ). Por lo tanto, las larvas expuestas a GLY muestran un efecto variable en el crecimiento entre las colonias. La colonia E no mostró una alteración en el crecimiento independientemente de la concentración de GLY. Mientras tanto, la colonia D mostró una reducción significativa de peso (alrededor del 27%) con una respuesta dependiente de la dosis en la exposición a 2.5 y 5.0 mg L -1de GLY. Además, las larvas de la colonia F mostraron un peso significativamente menor (15%) para la concentración más baja de GLY.
Fig 3. Efecto de la exposición a GLY sobre el crecimiento.
Las larvas expuestas in vitro a GLY (1.25–5.0 mg de GLY por litro de alimento) sin síntomas adversos visibles en el desarrollo larvario se tomaron muestras a los 5 días de edad de tres colonias (D, E y F). Medimos en cada larva su (a) diámetro de la cabeza (mm) y (b) peso (mg). El número de larvas medido fue de 10 para cada concentración por colonia. La prueba de Kruskal-Wallis seguida de comparaciones post hoc de Nemenyi se realizó para analizar datos morfométricos para comparar entre grupos (ns, sin diferencias significativas). GLM (peso ~ [GLY] + colonia + [GLY] × colonia) seguido de comparaciones post hoc de Tukey se llevó a cabo para analizar efectos simples en los datos de peso. Los grupos con letras diferentes tienen medios significativamente diferentes ( S4 y S6 Mesas).
Ninguna larva con mutación tardía se comió toda la comida ofrecida en ninguna de las colonias (FA). La comida experimental durante el período de alimentación fue una mezcla de diferentes nutrientes, principalmente de jalea real comercial. El pH fue ligeramente ácido (4,94 ± 0,05). El pH no cambió (4.9 ± 0.18) en los alimentos incubados durante cinco días en condiciones similares a las de las larvas criadas in vitro , lo que indica la estabilidad de algunas de sus propiedades. Sin embargo, los alimentos se volvieron ligeramente más ácidos cuando se agrega GLY en concentraciones de 2.5 y 5.0 mg L -1 (modelo GLMM: pH ~ [GLY] + (tiempo | replicar). Término [GLY]: F (3, 87) = 24 , P <0 .001.="" 0.5="" 6="" a="" as="" d="" de="" entre="" estructura="" font="" nbsp="" plicas.="" r="" s="" trav="" varianza:="" y="">Tabla S8 ).
Cambios en la expresión del gen intestinal de las larvas expuestas a GLY
La cría in vitro homogeneiza los factores ambientales y nutricionales entre las crías de diferentes colonias. Por lo tanto, la variabilidad en los efectos se explica principalmente por diferentes factores genéticos y / o epigenéticos entre la cría, asociados con la respuesta a un xenobiótico. La primera barrera interna a los alimentos contaminados es el intestino. Por lo tanto, realizamos un análisis exploratorio del perfil de expresión de genes inmunes / desintoxicantes ( Tabla 2 ). Tomamos muestras y diseccionamos larvas de 5 días de edad sin efectos adversos de desarrollo de las colonias estudiadas para las variables morfológicas (DF). También analizamos el perfil de expresión de enzimas digestivas y genes de biomarcadores de estrés ( Tabla 2) para determinar si la fisiología intestinal se había alterado como resultado de la exposición a GLY. Finalmente, comparamos la expresión génica entre larvas criadas en colmena e in vitro ( Fig . S3 ).
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| Tabla 2. Pares de cebadores específicos utilizados para amplificar cada gen por RT-PCR.
Por un lado, los niveles de expresión de enzimas digestivas y genes de biomarcadores estresores fueron similares entre las colonias con baja variabilidad (colmena: CVs 6–22%; in vitro : CVs 2-13%), lo que sugiere que las condiciones de cría in vitro sí No perturbar la fisiología intestinal. Sin embargo, encontramos una gran variabilidad en los niveles de expresión para algunos genes inmunes / desintoxicantes (en colmena: CVs 2-60%; in vitro : CVs 8-89%) entre colonias en ambos contextos con una tendencia considerable a un aumento en expresión en la cría in vitro .
Por otro lado, analizamos la capacidad de respuesta intestinal de las larvas expuestas a GLY. Debido a las diferentes líneas de base de la expresión génica entre las colonias en los grupos de control, relativizamos cada perfil de expresión a la muestra de control para comparar los patrones de respuesta ( Fig. 4A ). Los niveles de expresión de enzimas digestivas y genes de biomarcadores de estrés parecen similares entre las larvas expuestas y no expuestas. Sin embargo, los genes inmunes / desintoxicantes están regulados por GLY o sus subproductos como consecuencia de la exposición, con una respuesta diferencial entre las colonias. La colonia D mostró una baja regulación general de genes inmunes / desintoxicantes. Las colonias E y F mostraron regulación positiva independientemente de la concentración de GLY, especialmente en los genes CYP6AS2 y CYP9Q3, en ambas colonias. La colonia F mostró una regulación al alza del gen inmune Abaecina y una regulación a la baja de CYP6AS4 con una respuesta dependiente de la dosis opuesta a la de la colonia E. El método de agrupamiento ( Fig. 4B ) mostró una similitud entre las líneas de base de expresión de las colonias E y F al usar su Perfiles de expresión génica. Todas las muestras de larvas expuestas se agruparon por separado de las larvas de control ( Fig. 4B ). Además, se agruparon los perfiles de expresión de las muestras expuestas a las mismas concentraciones de GLY en las colonias E y F, lo que indica una respuesta similar para ambas colonias. Por lo tanto, la variabilidad en la regulación de genes inmunes / desintoxicantes podría explicar la variabilidad en la tolerancia a la exposición a GLY.
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Fig. 4. Variabilidad entre colonias en la respuesta génica a la exposición crónica a GLY.
Medición de los niveles de expresión génica en intestinos de larvas disecadas de 5 días de edad (criadas in vitro) de tres colonias (D, E y F) expuestas a diferentes concentraciones de GLY (1.25–5.0 mg de GLY por litro de alimento). Se evaluó un grupo de 10 intestinos para cada colonia y tratamiento (12 muestras). (a) El nivel de expresión de cada gen en exposición a GLY se relativizó al nivel de expresión basal de sí mismo (en ausencia del xenobiótico). Se trazó un diagrama de calor para cada colonia con su perfil de expresión relativa en cada concentración de GLY (escala logarítmica para la expresión genética relativa). Escala de colores: rojo para sobreexpresión y azul para subexpresión con respecto a su línea base. (b) Dendrograma del análisis de conglomerados jerárquico realizado entre muestras con expresión génica normalizada (valores de p de muestreo de arranque a múltiples escalas para la agrupación en cada borde).
Discusión
La evaluación actual in vitro muestra que GLY promueve cambios en la proporción de cría con alteraciones del desarrollo (es decir, cambios en su prevalencia), como muda tardía o incluso la muerte, en larvas de abejas alimentadas con alimentos contaminados (1.25–5.0 mg de GLY por litro de comida). Este efecto se observa principalmente como una duración prolongada de estadios larvarios tempranos y un crecimiento reducido. Estos efectos negativos para las larvas tratadas con GLY se encontraron en la mayoría de las colonias estudiadas (A, C, D y F) principalmente con 2.5 mg ae L -1del ingrediente activo. Sin embargo, la gran variabilidad entre ellos con respecto a la susceptibilidad a GLY es notable. Esta respuesta variable entre las colonias se explica por las diferencias en la proporción de larvas susceptibles en cada colonia (diversidad genética intracolonia) y por los diferentes umbrales de respuesta. En cuatro casos, las concentraciones de exposición indujeron efectos positivos en las colonias C, E y F. La transcripción de genes inmunes / desintoxicantes en el intestino larval se reguló de forma variable entre las colonias después de la exposición crónica a GLY. En consecuencia, en ausencia de inmunidad social y otros factores ambientales, la diversidad genética entre colonias podría explicar la variabilidad entre las colonias en los efectos de desarrollo y la susceptibilidad a GLY [ 42 , 43 , 50] Esto podría involucrar a uno o varios genes en los mecanismos de compensación de los diferentes genotipos, lo que resultó en fenotipos tolerantes (abejas asintomáticas). Sin embargo, la tolerancia a GLY no implica su inocuidad, contribuyendo a aumentar la carga alostática de una colonia.
Respuesta de larvas de abejas melíferas a GLY como estresante
Los estudios en vertebrados e invertebrados han demostrado desregulación del ciclo celular y efectos teratogénicos con enlaces moleculares entre los herbicidas basados en GLY y las vías de reordenamiento celular que subyacen al desarrollo animal [ 51 , 52 ]. De acuerdo con esto, se encontraron niveles elevados de apoptosis celular en el epitelio intestinal de las larvas de abejas después de la exposición in vitro a GLY [ 53 ]. La transcripción de algunos genes inmunes / desintoxicantes en el intestino larvario, como el gen de la proteína antibacteriana Abaecin y algunas monooxigenasas del citocromo P450, está regulada por la ingestión de GLY en nuestro estudio. Se encontraron resultados similares en un estudio anterior [ 54] Aunque se informó que este efecto era reversible, todas estas alteraciones en la fisiología celular del intestino son consistentes con el estrés inducido químicamente [ 55 ] y una microbiota alterada [ 56 ].
Una nutrición adecuada es esencial para lograr un desarrollo óptimo cuando se enfrenta a la exposición a factores estresantes [ 3 ]. Las abejas obreras jóvenes mostraron una ingesta reducida de cría de alimentos cuando estaba contaminada con GLY [ 27 ]. Sin embargo, las larvas con retraso en el desarrollo no comen todos los alimentos ofrecidos, independientemente de si han estado expuestos a GLY o no. Específicamente, el proceso de muda depende de la tasa de crecimiento, que está vinculada a la alimentación, que se homogeneiza in vitro.evaluación. Como los alimentos son una limitación para la inmunidad de la cría, sus propiedades son importantes en estas condiciones. En este sentido, la acidificación de la cría de alimentos por GLY tiene consecuencias desconocidas. El desencadenamiento de mecanismos compensatorios de estrés induce el consumo de energía que podría interrumpir el proceso de muda y podría provocar la muerte si las larvas tienen baja tolerancia individual. Las colonias D y F mostraron una reducción en el crecimiento larvario incluso si las larvas no mostraron muda tardía. No sabemos las causas de la reducción en el comportamiento de alimentación. Sin embargo, la desnutrición podría conducir a una compensación ineficiente del estrés debido a una compensación entre crecimiento y desintoxicación [ 31 ].
Detectamos principalmente efectos adversos de desarrollo in vitro para larvas de abejas melíferas con una respuesta a la dosis no monotónica, es decir, altas respuestas a dosis intermedias. Diferentes hipótesis pueden explicar este tipo de patrón; efectos metabólicos, pluralidad de dianas moleculares, regulación de retroalimentación negativa y múltiples mecanismos antagonistas con diferentes umbrales [ 57] La respuesta a la dosis depende de la duración de la exposición y del tiempo de asimilación de la sustancia. La relación entre la concentración de exposición y la dosis efectiva no es necesariamente lineal. Por lo tanto, los efectos positivos pueden explicarse por eventos de exposición a bajas dosis a corto plazo que podrían mejorar la salud de las personas debido a la regulación de los genes de inmunidad. En consecuencia, se necesitan más estudios para comprender el mecanismo de acción de GLY ingerido durante el desarrollo larvario. Nuestra evaluación se centró en la etapa larval, por lo que los efectos sutiles durante la pupación de las larvas tolerantes con o sin crecimiento reducido siguen siendo desconocidos.
Implicaciones de las condiciones de exposición in vitro.
La presencia de GLY no parece modificar la aceptación de la cría de alimentos ni por las larvas tolerantes ni por las abejas recolectoras de miel [ 26 ]. Esta respuesta se observó a pesar de que GLY acidificó ligeramente la dieta. Esto nos permite calcular la dosis total de herbicida adquirida durante el período de alimentación antes de la defecación (alrededor de 144 h de edad) [ 32 , 33 ]. Cada larva recibió una dosis total de GLY de 137.5, 275 y 550 ng ae por tratamiento. Vale la pena señalar que la EFSA propone que los efectos de los plaguicidas en las colmenas se prueben utilizando exposiciones con una dosis promedio de 9500 ng ae por larva durante el período de desarrollo de 5 días antes del sellado [ 58] Esto es casi 20 veces mayor que las dosis más altas que utilizamos. Se detectaron efectos perjudiciales en el desarrollo con niveles de GLY por debajo de 20.49 mg ae kg -1 en nuestro estudio (estimado para diez larvas de 5 días expuestas a 1.25 mg ae L -1 ). En condiciones de semi-campo, un estudio previo reportó concentraciones de 1.23 a 19.5 mg ae kg -1 en muestras de cría [ 35 ], sin efectos visibles de desarrollo o supervivencia. Sin embargo, encontramos una reducción del 21% en el peso de las larvas criadas in vitro con respecto a las larvas criadas en la colmena, lo que es evidencia de desnutrición ( Fig . S2 ). Larvas criadas in vitroTambién mostró una menor variabilidad en el peso con un diámetro de cabeza similar al de las larvas criadas en la colmena , debido a la nutrición homogeneizada y al volumen constante de alimentos. Además, las larvas de abejas expuestas a GLY in vitro mostraron síntomas de estrés que serían compensados en la colmena por el cuidado de las abejas nodrizas, lo que promueve una carga alostática en la colonia [ 5 ]. Por lo tanto, no se puede ignorar el estado de desnutrición y la ausencia de inmunidad social de las larvas criadas in vitro .
En estudios previos, las larvas mostraron una tolerancia diferente a los estresores entre las colonias tanto en contextos de colmena [ 59 ] como in vitro [ 38 ]. En nuestro estudio, los resultados indican variación en la susceptibilidad a GLY entre colonias. La cría in vitro minimiza los estresores ambientales y homogeneiza las condiciones de cría, excluyendo así otros estresores en la colmena que descompensan simultáneamente la homeostasis. La variabilidad de la expresión génica según el contexto de crianza también se muestra en nuestro estudio, lo que podría ser una consecuencia de las diferencias en la composición de la dieta entre la cría en colmena y la cría in vitro . Además, la ausencia de inmunidad social en la cría in vitro mejoró las defensas individuales (S3 Fig ).
El procedimiento in vitro no imita la vía de exposición a agroquímicos en condiciones de colmena en las que la frecuencia y la cantidad de alimentos ofrecidos varían de acuerdo con la demanda de larvas y el suministro proporcionado por las abejas nodrizas [ 60 , 61 ]. Por lo tanto, la exposición in vitro actúa como el peor de los casos con una inmunidad individual predominante. Sin embargo, este procedimiento nos permite evaluar la capacidad de respuesta específica a GLY. Por lo tanto, la variación entre individuos y entre colonias en la susceptibilidad a estresores para el procedimiento in vitro se vuelve importante. Además, solo podemos evaluar la toxicidad del herbicida a nivel individual.
Perspectivas para la evaluación de toxicidad de GLY en abejas melíferas
Hoy en día, los agroecosistemas están expuestos a cantidades crecientes de GLY como consecuencia de aplicaciones no racionales y malezas resistentes que disminuyen la efectividad del herbicida [ 62 ]. El monitoreo de campo y las evaluaciones controladas por laboratorio de la toxicidad GLY siguen siendo esenciales. La integración de la información obtenida de ambos procedimientos sería deseable para proporcionar una mejor comprensión del impacto agroquímico en las colmenas expuestas en condiciones de campo realistas [ 63 , 64 ]. Incluso si el in vitroNo se puede considerar que el procedimiento refleje completamente la toxicidad para las larvas dentro de una colmena, se puede considerar como una herramienta confiable en un primer paso para determinar los efectos adversos sutiles. Se desconoce el impacto de las formulaciones de herbicidas a base de GLY en la abeja melífera y la interacción con múltiples factores como patógenos, otros pesticidas o condiciones ambientales adversas. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que la exposición al ingrediente activo de estos herbicidas podría afectar el desarrollo de la cría con consecuencias impredecibles a largo plazo a nivel de colonia. Las evaluaciones que no tienen en cuenta la variación de susceptibilidad entre las colmenas pueden cuantificar incorrectamente los efectos adversos.
materiales y métodosSitio de estudio y animales
Los experimentos se realizaron de enero a marzo durante la temporada de verano del hemisferio sur. Se tomaron muestras de larvas de seis colonias libres de enfermedad (AC en 2014 y DF en 2015) de abejas melíferas occidentales ( Apis mellifera ligustica Spinola) y se criaron in vitro (ver más abajo). Las colonias se compraron a un productor reina comercial en noviembre de cada año y se alojaron en nuevas colmenas Langstroth en el colmenar experimental de la Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina (34 ° 32 'S, 58 ° 26' W). Las nuevas seis reinas no estaban relacionadas genéticamente (padres diferentes; es decir, diversidad genética entre colonias) y fueron inseminadas naturalmente por múltiples parejas durante los vuelos libres en el campo (es decir, diversidad genética dentro de colonias).
Crianza in vitro
Introdujimos un marco vacío en la colonia de origen (AF) y lo monitoreamos durante 8 horas hasta que la reina había puesto suficientes huevos. Tres días después retiramos el marco de cría y lo llevamos a una habitación adecuada para el injerto. Injertamos alrededor de 120 larvas del primer estadio (de 0 a 8 horas después de la eclosión) del marco de cría a vasos de plástico y los colocamos en placas de Petri. Esta cantidad de larvas representaba alrededor del 10% de la cohorte (huevos puestos en un día por la reina) y hasta el 1% de la colonia. Para evitar la variabilidad en el efecto del injerto, el mismo investigador realizó este procedimiento. Las larvas se criaron dentro de una incubadora con temperatura constante y humedad relativa (34.5 ° C y 95%, respectivamente) durante cinco días [ 44] Con el fin de prevenir la contaminación bacteriana o fúngica y la posterior infección, mantuvimos condiciones estériles y eliminamos los muertos diariamente [ 44 ]. Para estandarizar la administración de alimentos larvales, proporcionamos 160 μl de alimento extendido en seis partes alícuotas de volumen creciente a cada larva durante los seis días del período de alimentación: 10 μl durante el injerto, 10 μl a las 24 h, 20 μl a las 48 h, 30 μl a 72 h, 40 μl a las 96 hy 50 μl a las 120 h [ 65 ]. Utilizamos una dieta previamente establecida: 6% de D-glucosa, 6% de D-fructosa y 50% de jalea real comercial [ 66 , 67 ]. Realizamos una sesión de injerto para cada colonia de origen por tratamiento cada 2-3 días para excluir las diferencias estacionales.
Exposición a GLY
Para evaluar el efecto de la exposición a GLY (estándar analítico, pureza del 99,2%) en larvas criadas in vitro , asumimos el peor escenario de exposición. No conocemos la concentración de GLY en los alimentos de cría durante la exposición en el campo, pero en realidad las larvas ingieren GLY [ 36 ]. Todavía no existe un procedimiento bioquímico para medir con precisión los rastros de GLY en la jalea real, pero se han detectado otros pesticidas [ 22 ]. En consecuencia, hemos elegido una exposición crónica a GLY considerando las concentraciones ambientales medidas en paisajes naturales y agrícolas cuando se usaron aplicaciones recomendadas o excesivas del herbicida [ 23 - 25] Definimos cuatro tratamientos: grupo control (alimento sin herbicida), 1.25, 2.5 y 5 mg ae de GLY por litro de alimento. Para preparar la mezcla de alimentos para cada concentración, diluimos una solución madre de 100 mg ae L -1 que renovamos una vez a la semana debido a una ligera fotodegradación de GLY [ 11 ]. Finalmente, también medimos el pH de la mezcla de alimentos de cada tratamiento durante el experimento.
Desarrollo larval
A lo largo del período de crecimiento / alimentación, cuatro mudas permiten que la larva de una abeja aumente de tamaño, lo que determina cinco estadios [ 32 ]. Normalmente, se produce una muda cada 24 horas hasta los 4 días posteriores a la eclosión (96 h). Cada estadio se puede identificar diariamente por el diámetro de la cabeza de la larva y su morfología [ 32 - 34 ] ( S1 Fig ). Cuando una larva tiene un tamaño más pequeño o características diferentes del estadio en el que se espera que se encuentre, se clasificó como demorada.
Ingestión y crecimiento de alimentos.
Al final del período de alimentación (quinto estadio), las larvas comen todos los alimentos ofrecidos en ambos contextos de cría. Además, dentro de la colmena y antes de la pupación, las abejas lactantes sellan las células aproximadamente 120 horas después de la eclosión. Por lo tanto, muestreamos y pesamos larvas de 5 días de edad con una ingesta completa de alimentos (110 μl de alimentos ingeridos) de tres colonias (DF) para comparar el crecimiento entre las diferentes concentraciones de GLY (10 larvas por concentración y colonia). Utilizamos una balanza electrónica (Mettler Toledo AG285, ± 0.1 mg) y medimos el diámetro de la cabeza con un microscopio estereoscópico (Leica MZ8) para una identificación morfométrica del estadio. Como existen diferencias ambientales, nutricionales y sociales con la cría en colmena, tomamos muestras de larvas de la misma cohorte para comparar la línea de base nutricional entre contextos ( Fig. S2) Para la cría en colmena, tomamos muestras en las tres colonias de diez larvas de 5 días de edad de células selladas antes de la hilatura (es decir, las larvas permanecieron en el fondo de la célula antes de cambiar su posición).
Disección del intestino.
Analizamos el perfil de expresión de algunos genes en el intestino como un parámetro para evaluar las defensas y la salud de la cría ( Tabla 2 ). Para esto, muestreamos larvas de 5 días de edad en el quinto estadio de tres colonias (DF, en ambos contextos de cría como en la sección anterior) con una ingesta completa de alimentos (la misma dosis de GLY y estado nutricional, Tabla S1 ). Los diseccionamos bajo un microscopio estereoscópico y agrupamos 10 intestinos para cada contexto de cría y cada tratamiento GLY por colonia. Las tripas agrupadas se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN.
Extracción de ARN
Homogeneizamos muestras intestinales larvales usando una mano de mortero y mortero en presencia de nitrógeno líquido. Siguiendo las instrucciones del fabricante, se extrajo el ARN poliadenilado usando el kit de aislamiento de ARNm (Roche Molecular Biochemicals). Cuantificamos la concentración de ARNm utilizando el fluorómetro Qubit (Invitrogen).
Procedimiento de RT-PCR
Estimamos la acumulación de transcripción de todos los genes a través de un procedimiento semicuantitativo con RT-PCR. El ADNc se sintetizó con 50 ng de ARNm por muestra por medio del sistema de transcriptasa inversa Revert AidTM M-Mul V (Fermentas International Inc.). Las PCR se realizaron con ADN polimerasa GoTaq (Promega). Los cebadores específicos de PCR para todos los genes analizados se diseñaron para secuencias de nucleótidos conservadas ( Tabla 2 ). Las condiciones de recocido para cada par de cebadores se optimizaron empíricamente para determinar el rango lineal de amplificación ( Tabla S9 ). La actina se usó como control endógeno para normalizar la cantidad de plantilla inicial.
Análisis de expresión génica
Separamos los productos de RT-PCR de los genes diana y el control endógeno en geles de agarosa al 1.5% ( S4 Fig ), teñidos con tinción de ácido nucleico GelRed (Biotium) y visualizados por el software de adquisición de imágenes Doc-It LS de UVP. Medimos la intensidad de las bandas y las comparamos con un marcador molecular estándar cargado en el mismo gel (escalera de ADN de 100 pb, Invitrogen). Para analizar la respuesta de cada gen en exposición al glifosato, relativizamos sus niveles de expresión a su nivel de referencia de control.
Estadísticas
Realizamos análisis de datos y gráficos en R (para más detalles, consulte el Apéndice S1 ). Los datos de supervivencia y desarrollo se analizaron con modelos de tiempo de falla acelerado (ATF). Los datos de pesaje se analizaron con modelos lineales generalizados (GLM). Debido a que el diámetro de la cabeza alcanzó errores de no normalidad con diferentes distribuciones, realizamos una prueba de Kruskal-Wallis. El análisis jerárquico de conglomerados se realizó con valores p de remuestreo de arranque multiescala para clasificar la capacidad de respuesta genética para la agrupación en cada borde. El nivel alfa se estableció en 0.05 y el valor p se corrigió para múltiples comparaciones post hoc con el procedimiento de Bonferroni.
Tabla S2. Efectos simples informados en modelos ATF con interacción significativa.
Comparación post hoc múltiple de curvas de supervivencia ([GLY] × término de colonia, χ 2 (15) = 211.29, P <0 .001="" colonia="" curvas="" de="" exitosas="" font="" muda="" nbsp="" rmino="" t="" y="">2 (15) = 207.24, P <0 .001="" cada="" colonia.="" en="" entre="" font="" nbsp="" tratamientos="">Estadísticas de las pruebas de Log-rank (df = 1) para comparar un par de concentraciones de GLY y valor p corregido con el procedimiento de Bonferroni (diferencias significativas en negrita).
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Tabla S3. Los efectos simples para las larvas criadas in vitro sin GLY informaron en modelos ATF con interacción significativa.
Comparación post hoc múltiple de curvas de supervivencia de control ([GLY] × término de colonia, χ 2 (15) = 211.29, P <0 .001="" colonia="" control="" curvas="" de="" exitosas="" font="" muda="" nbsp="" rmino="" t="" y="">2 (15) = 207.24, P <0 .001="" colonias.="" entre="" font="" nbsp="">Estadísticas de las pruebas de Log-rank (df = 1) para comparar un par de colonias debajo de la diagonal gris y el valor p corregido con el procedimiento de Bonferroni sobre la diagonal gris (diferencias significativas en negrita).
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S4 Tabla. Comparación post hoc múltiple del diámetro de la cabeza entre tratamientos.
Estadísticas de la prueba de Nemenyi (df = (15, 135)) para comparar un par de concentraciones de GLY o contextos de cría en cada colonia. El valor P se corrigió con el procedimiento de Bonferroni.
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S5 Tabla. Comparación post hoc múltiple del diámetro de la cabeza entre colonias.
Estadística de la prueba de Nemenyi (df = (15, 135)) para comparar un par de colonias en cada contexto de cría. El valor P se corrigió con el procedimiento de Bonferroni.
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S6 Tabla. Efectos simples reportados en el modelo GLM con interacción significativa.
Comparación post hoc múltiple de peso entre grupos ([GLY] × término de colonia, F (6,108) = 16.33, P <0 .001="" n="120). </font">Estadísticas de la prueba de Tukey para comparar un par de concentraciones de GLY en cada colonia. El valor P se corrigió con el procedimiento de Bonferroni (diferencias significativas en negrita).
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Tabla S7. Efectos simples reportados en el modelo GLM con interacción significativa.
Comparación post hoc múltiple de peso entre grupos ([GLY] × término de colonia, F (6,108) = 16.33, P <0 .001="" n="120). </font">Estadísticas de la prueba de Tukey para comparar un par de colonias en cada concentración de GLY. El valor P se corrigió con el procedimiento de Bonferroni (diferencias significativas en negrita).
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S8 Tabla. Cambios en el pH medio de los alimentos ofrecidos durante la evaluación in vitro .
Se han medido cinco réplicas por tratamiento diariamente durante 5 días en la incubadora (34.5 ° C y 95% HR). GLMM seguido de la prueba de Tukey para comparar un par de concentraciones de GLY. Los tratamientos con letras diferentes tienen medios significativamente diferentes.
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S9 Tabla. Las condiciones del procedimiento para cada par de cebadores en la RT-PCR se optimizaron empíricamente para determinar el rango lineal de amplificación.
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Tabla S10. Comparación de los niveles de expresión génica evaluados entre contextos de cría.
Estadísticas de la prueba U de Mann-Whitney para comparar un par de genes en cada contexto de cría (en colmena o in vitro ).
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S1 Fig. Desarrollo larval durante el período de crecimiento.
Día a día secuencia fotográfica del desarrollo esperado. El período de crecimiento y alimentación corresponde a las primeras 144 horas después de la eclosión. A) 0–17 h: primera larva del estadio (I) (encerrada en un círculo rojo). El instar (1,5 mm) tiene una cutícula translúcida y una cabeza que es difícil de observar a simple vista. B) 17–36 h: Segunda larva del estadio (II). El instar (2 mm) tiene una cabeza visible pero con mandíbulas muy pequeñas y una cutícula blanquecina opaca. C) 36–57 h: Tercera larva del estadio (III). El instar (3 mm) tiene una apariencia robusta y una cutícula blanquecina brillante. D) 57–85 h: Cuarto estadio (IV) larva. El instar (4 mm) tiene una cabeza de gran diámetro. E) 85–115 h: quinta larva del estadio (V). El quinto estadio inicial (6 mm) tiene mandíbulas visibles y muestra un gran aumento de la masa corporal en relación con la cabeza. F) 115–160 h:
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S2 Fig. Efecto del contexto de crianza en el crecimiento.
Las larvas sin síntomas adversos en el desarrollo larvario se muestrearon a los 5 días de edad de tres colonias (D, E y F) en ambos contextos de cría (en colmena e in vitro ). Medimos en cada larva su (a) diámetro de la cabeza (mm) y (b) peso (mg). El número de larvas medido fue de 10 para cada contexto de cría por colonia. La prueba de Kruskal-Wallis (diámetro de la cabeza ~ tratamiento. El tratamiento como una combinación de contexto de crianza y colonia) se llevó a cabo para analizar los datos morfométricos para comparar entre los grupos (χ 2(5) = 16,48, P = 0,005). GLS se llevó a cabo para analizar datos de peso para comparar entre grupos. (Modelo GLS: peso ~ contexto de crianza + colonia + contexto de cría × colonia. Factores fijos: LR (2) = 57.4, P <0 .001="" 0.45="" 54.82="" a="" colonia="" contexto="" cr="" crianza="" de="" estructura="" font="" la="" lr="" n="60." nbsp="" p="" para="" rmino="" t="" varianza:="">Los grupos con asteriscos tienen medios significativamente diferentes.
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S3 Fig. Efectos del contexto de crianza en la expresión génica dentro del epitelio intestinal.
La medición del nivel de expresión medio de 16 genes se realizó en tripas de larvas diseccionadas de 5 días de edad tomadas de tres colonias (D, E y F) en ambos contextos de cría (en colmena o in vitro ). Se evaluó un grupo de 10 intestinos para cada colonia y contexto (6 muestras). El nivel de expresión de actina se ha utilizado para normalizar el nivel de expresión de cada gen. Las barras indican medias ± sem de la prueba U de Mann-Whitney para comparar los contextos de cada gen (sin diferencias significativas, tabla S10 ).
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S4 Fig. Electroforesis en gel de productos de RT-PCR de los genes diana en cada muestra intestinal larval.
Muestras de 10 intestinos de larvas de 5 días de edad (criadas en colmena o in vitro ) muestreadas de tres colonias (D, E y F) expuestas a diferentes concentraciones de glifosato (1.25–5.0 mg. De GLY por litro de alimento ) Se realizó un gel de agarosa para cada gen en todas las muestras.
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Conjunto de datos S1. Datos de fila de todas las mediciones en la evaluación GLY.
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Expresiones de gratitud
Agradecemos a Héctor Verna por su asistencia técnica durante el período experimental y Lucila Herbert por su contribución en la redacción del manuscrito.
Referencias
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