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ASAMBLEA NACIONAL DE APICULTORES URUGAUY 19 DE NOVIEMBRE 2016

martes, 15 de diciembre de 2015

SEMILLAS DE MAÍZ CUBIERTAS CON NEONICOTINOIDES AFECTAN INDIRECTAMENTE EL RENDIMIENTO DE LAS ABEJAS MELLIFERAS Y SU SUCEPTIBILIDAD A LOS PATÓGENOS, SEGÚN PRUEBAS DE CAMPO

Mohamed Alburaki, 1, 3, ¤ Sébastien Boutin, Pierre-Luc Mercier, 1, Yves Loublier, Madeleine Chagnon, 4 y Nicolas Derome 1, 2
César Rodríguez-Saona, Editor Académico


abstracto

Treinta y dos de abejas (Apis mellifera) colonias fueron estudiados con el fin de detectar y medir potencialesin vivo efectos de los plaguicidas neonicotinoides utilizados en los campos de maíz (Zea mays spp) en la salud de las abejas. Colonias de abejas se dividieron aleatoriamente en cuatro áreas agrícolas maizal diferentes situados cerca de la ciudad de Quebec, Canadá. Dos lugares contenían campos de maíz tratados con un insecticida neonicotinoide sistémica semillas recubiertos mientras que los otros dos eran los campos de maíz orgánicos utilizados como tratamientos de control. La urticaria se controlaron ampliamente por sus rasgos de comportamiento y de salud durante un período de dos años. Virus de la abeja (BQCV virus de célula reina cría, el virus de las alas deformadas DWV, e israelí virus de la parálisis aguda IAPV) y la expresión específica del cerebro de un biomarcador de estrés fisiológico anfitrión, el gen AChE La acetilcolinesterasa, se investigaron mediante RT-qPCR. Se realizó cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para detectar residuos de plaguicidas en las abejas adultas, miel, polen y flores de maíz recogidos de las colmenas estudiadas en cada lugar. Además, las condiciones generales de la colmena se evaluaron mediante el control de peso y el desarrollo de colonias de cría. Los neonicotinoides solamente se identificaron en flores de maíz a bajas concentraciones. Sin embargo, las colonias de abejas ubicadas en campos de maíz tratados neonicotinoides expresaron significativamente mayor infección por patógenos de los ubicados en los campos de maíz no tratadas. Niveles de AChE mostraron niveles elevados entre las abejas que recogen el polen de maíz de los campos tratados. Correlaciones positivas se registran entre los agentes patógenos y los lugares tratados. Nuestros datos sugieren que los neonicotinoides se debilitan indirectamente salud de las abejas mediante la inducción de estrés fisiológico y el aumento de las cargas de patógenos.

Ir:

Introducción

Las poblaciones de abejas en todo el mundo han disminuido significativamente en la última década [1, 2]. El fenómeno de la disminución de abejas mundial representa un desafío importante para los apicultores y científicos por igual. Sus causas todavía no están bien comprendidos. Varios estudios ponen de relieve el impacto de patógenos endémicas y emergentes  - siete]; otros culpan al uso excesivo de pesticidas [1, 8].Residuos químicos múltiples de origen sintético se han detectado en el interior de las colmenas de abejas, incluidos los plaguicidas utilizados en el tratamiento de varroa [9, 10]. Sin embargo, ningún factor individual como el medio ambiente, los pesticidas o patógeno, parece actuar como el principal motor de Colony Collapse Disorder (CCD) u otras pérdidas de abejas. Así, la masiva disminución de las poblaciones de abejas en el mundo es ampliamente considerado como un fenómeno multifactorial [11].
El declive de las poblaciones de abejas tiene implicaciones importantes para la polinización de las plantas, incluyendo muchos cultivos domesticados [12]. De hecho, varios autores prevén una crisis de polinización inminente que amenace la seguridad alimentaria en todo el mundo [13, 14]. El valor de los cultivos polinizados por las abejas se estimó en 2000 en $ 14.6 mil millones de dólares en los Estados Unidos solamente [15]. En los Estados Unidos, el número total de colonias de abejas ha disminuido en un 45% en los últimos 60 años [16]. La mayoría de las pérdidas antes de 1979 se atribuyeron a organoclorados, carbamatos y la exposición a plaguicidas piretroides [17]. En Canadá, las pérdidas de colonias parecen ser menos grave que en los EE.UU., aunque los datos son menos completa. Pérdidas de invernada en 2009-2010 se notificaron al 23,8%  mientras que otros estudios muestran una disminución de la mortalidad de abejas en Canadá del 35% en 2007 al 15% en 2012 [19].
Con los años, las clases de pesticidas utilizados en la agricultura y sus métodos de aplicación han cambiado sustancialmente. Carbamatos, piretroides y organoclorados, conocidos por su toxicidad ambiental y tradicionalmente se pulveriza directamente sobre las plantas de cultivo, han sido menos utilizados por el favor de nuevas clases de pesticidas sistémicos (neonicotinoides y fenilpirazoles). Los neonicotinoides y fenilpirazoles, comúnmente aplicados como semillas revestimientos para limitar el contacto con las plantas no objetivo y los insectos, se cree que son menos dañinos para los polinizadores. Sin embargo, varios in vitroestudios han puesto de manifiesto la alta toxicidad de los neonicotinoides como clotianidina y tiametoxam a la abeja [20]. En el campo, la toxicidad letal pesticida entre las abejas ha sido ampliamente estudiado a través de múltiples clases de agentes sintéticos [8, 18,  - 24]. En tales casos, la toxicidad letal se confirma fácilmente a través de la presencia de abejas muertas delante de las colmenas. Sin embargo, pocos estudios tratan de los efectos de las dosis subletales de los plaguicidas sobre las abejas. Se sabe que las dosis subletales agotan las actividades esenciales de insectos  - [29]. Dosis subletales disminuyen significativamente los trastornos de rendimiento abeja y disparo en la dinámica de colonias y partición de trabajo [24, 30]. Por otra parte, se ha demostrado que los comportamiento de las abejas, la orientación, bailes de comunicación y vuelta Vuelos, especialmente para los recolectores, son altamente afectados por dosis subletales de plaguicidas [31, 32].Dosis subletales de los neonicotinoides, en particular, son conocidos por afectar la memoria olfativa y la capacidad de aprendizaje de las abejas  - [36, 37]. Actualmente los métodos químicos analíticos disponibles, tales como técnicas de espectrometría de cromatografía de masas líquidas, tienen un límite muy bajo de detección de LOD para neonicotinoides [38]. Sin embargo, la evaluación del cuadro interior de ambos exposición subletal neonicotinoides y su efecto tóxico consecuente necesita el desarrollo de herramientas de integración, que combinan ambos biomarcadores fisiológicos altamente sensibles y técnicas de detección química. Dado que los datos relativos a las perturbaciones de comportamiento inducido con insecticida es necesariamente de naturaleza cuantitativa, nos centramos en la eficiencia de un biomarcador cuantitativa de estrés neurofisiológico.
Un estudio reciente ha vinculado toxicidad subletal neonicotinoide con un aumento en la actividad de la acetilcolinesterasa (AChE) en la abeja melífera [39]. Expresiones niveles de este neuromodulador por lo tanto proporcionan una valiosa representación cuantitativa. Por lo tanto, los niveles de expresión de este nuevo biomarcador fueron atacados en este estudio junto con medidas más clásicas de la condición de la colmena, con el fin de evaluar los efectos potenciales de los neonicotinoides recubierto Zea mays spp (en adelante 'maíz') las semillas en la salud de la abeja. Con el fin de reflejar más fielmente la naturaleza de los in vivoimpactos neonicotinoides en la salud de la abeja, que investigó la toxicidad de los neonicotinoides y cualquier posible sinergia que une la proximidad de los neonicotinoides tratado campo de maíz con los patógenos estudiados y la expresión de AChE. Comparaciones longitudinales múltiple entre colonias se realizaron en el contexto de la actividad de forrajeo de abeja natural y, en un sistema experimental que comprende campos de maíz de replicados tratados y no tratados con el fin de aislar el efecto del tratamiento. Nuestros resultados muestran que las colonias de abejas de forrajeo cerca de campos de maíz tratados mostraron significativamente más alta expresión de AChE, aumentaron la carga viral, así como el aumento de la infestación de varroa durante el año de estudio. Aparte de estos resultados significativos, las medidas clásicas de la colmena condición de masas y cría conde-exhibieron menos perturbaciones.

Materiales y métodos

Declaración de Ética

Sin permiso específico se requiere para ejecutar este estudio en estos lugares. Nuestros estudios de campo no involucran especies amenazadas o protegidas. El GPS coordenadas de cada lugar han sido los siguientes: N ° 1 (46 ° 40'31 N 71 ° 54'57 W), N ° 2 (46 ° 38'38 N 71 ° 56'56 W), N ° 3 ( 46 ° 40'04 N 72 ° 00'26 W) y N ° 4 (46 ° 35'04 N 72 ° 14'58 W).

Colonias y lugares de abejas

Este estudio se basó en 32 colonias de abejas administradas, proporcionados por un apicultor local en Quebec. Las colonias eran nuevas divisiones sanas de 2012, iguales en tamaño de la población, provistos de reinas recién fertilizados y probados. Las abejas se recibieron el 28 de junio de 2012 en las colmenas temporales. Luego fueron trasladados a 32 nuevas colmenas Langestroth. Las colonias se dividieron en cuatro apiarios de 8 colonias cada una el 1 de julio de 2012. Los colmenares se distribuyeron en cuatro grupos diferentes de campos de maíz al suroeste de Quebec (Figura 1 y Tabla1).
Ubicación de los cuatro colmenares de abejas al suroeste de la ciudad de Quebec.
Cada apiario consistió en ocho colmenas de abejas. Colmenares 1 y 4 (color bleu) se encuentran en los campos de maíz no tratadas, mientras que las explotaciones apícolas 2 y 3 (color rojo) están en campos sembrados con semillas neonicotinoides tratada. Cada cuadrado representa una colmena de abejas.

Dos colmenares (N ° 1 y 4) fueron colocados en zonas campo de maíz agrícolas que no utilizaron el tratamiento de semillas, mientras que las explotaciones apícolas (N ° 2 y 3) fueron colocados en campos de maíz tratados a través de la semilla de recubrimiento con un insecticida comercial con tiametoxam como ingrediente activo (Cruiser, Syngenta, Canadá) que pertenece a la clase de los neonicotinoides, la Tabla1.Los cuatro sitios de apiarios están ubicados en una zona geográfica donde el clima, las condiciones ambientales y la flora son muy similares. Sitios Apícolas (N ° 1 y 4) se encuentran en dos áreas del campo de maíz orgánicos mientras que los sitios colmenar (N ° 2 y 3) contener principalmente enormes campos de maíz tratados con recubierto de semillas neonicotinoides. En condiciones normales, las recolectoras de abejas vuelan entre (1,5-5) km de distancia si abundantes fuentes de alimentos están cerca [40]. En nuestro caso, la distancia más corta era de 5 km, entre ambos campos tratados (N ° 2 y 3). Esto supone que una contaminación cruzada es mucho que se produzca, como la distancia más corta entre los lugares estudiados fue de unos 5 km. Sin embargo, ambas otros colmenares (ubicaciones) sin tratar estaban bien aislado como la distancia era más de 20 km entre ambos (N ° 2 y 3) y N ° 4 (Fig1). Hasta donde sabemos, no se utilizaron otros pesticidas químicos en los campos de maíz tratados como fungicidas o herbicidas. No excluimos el uso probable de estos pesticidas en otras culturas en las zonas tratadas. La rotación de cultivos en las cuatro áreas estudiadas (N ° 1, 2, 3 y 4) son la mayoría de las veces se concentra entre el maíz Z. Mays y trébol blancoTrifolium sp.

Abeja adulta y toma de muestras de miel

Cincuenta abejas obreras adultas por colonia se muestrearon cuatro veces; antes, durante y después de la floración de maíz, así como punto de una vez durante la invernada (Tabla1). Las abejas fueron flash de congelados en nitrógeno líquido durante 10 segundos e inmediatamente pusieron en hielo seco hasta llegar al laboratorio y se almacenan a -80 ° C. Entre las cincuenta muestras de abejas de cada colonia, veinticinco abejas fueron recogidos y utilizados para otros estudios moleculares al azar. Las muestras sobrantes se mantuvieron como una copia de seguridad para su posterior análisis. Además, otros 100 abejas obreras se tomaron muestras de cada colonia en las mismas cuatro puntos de tiempo mencionados anteriormente. Estos cien abejas procedentes de cada uno de los ocho colonias de colmenar, se agruparon y se tratan como una muestra por apiario para cada punto de tiempo y se utilizaron para la detección química de pesticidas. Las muestras de miel se recogieron de cada colmena al final del periodo de floración de maíz. Múltiples muestras de miel fueron tomadas de diferentes marcos de miel de cada colmena. Las muestras de miel recogidas de los ocho colmenas de cada ubicación se agruparon y se tratan como una muestra por apiario en los análisis posteriores (Tabla1). Además, se tomaron muestras al azar flores de maíz de cada sitio durante el período de floración y conservados a -20 ° C para el análisis químico.

Análisis de ADN mitocondrial

Con el fin de determinar el origen materno de las colonias estudiadas, una prueba COI-COII ADNmt - Brevemente, el ADN fue extraído a partir del tórax utilizando el método de Chelex  la amplificación PCR estándar de la región intergénica COI-COII del ADNmt se realizó seguida de una migración de electroforesis en 1,4% de gel de agarosa con el marcador molecular MIII (Sigma-Aldrich Biotechnology) y la variación de tamaño de fragmento amplificado utilizado para determinar linaje. El linaje evolutivo de cada colonia estudiada se determinó de acuerdo a los diferentes patrones de la región intergénica ADNmt COI-COII amplificada (ex. Patrón de Q para el linaje del Mediterráneo Norte C y (PQ, PQQ, PQQQ) las pautas de Occidente Mediterráneo linaje M) - 44].

Extracciones de ARN

ARN total fue extraído de abeja cerebro y el abdomen utilizando el reactivo TRIzol protocolo de Invitrogen con algunas modificaciones. Brevemente, los cerebros y abdómenes de las abejas 25 de cada colonia se diseccionaron y se añaden por separado a 1 ml de Trizol con 5 mg de ácido se lavó perlas de vidrio y se mezclaron suavemente durante 2 min. Se añadieron 300 l de cloroformo y la mezcla total se incubó a temperatura ambiente durante 15 min seguido de una centrifugación a 12.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante se lavó con 250 ml cada uno de isopropanol y 1,2 M de citrato de sodio con la incubación durante 10 min a temperatura ambiente, seguido por centrifugación a 12.000 rpm durante 10 min a 24 ° C. El sedimento se lavó dos veces con posteriormente 1 ml de etanol 75% y se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 min a 24 ° C. Por último, el sedimento de ARN se secó y se añadieron 30 l de agua libre de nucleasa. ARN se almacenó a -80 ° C para análisis posteriores.

La detección de la expresión génica AChE y patógenos

Un solo paso de transcripción inversa PCR cuantitativa (RT-qPCR) se utilizó para cuantificar la expresión del gen de la acetilcolinesterasa (AChE), así como para evaluar la carga viral para tres de los virus más comunes en Canadá: 1- virus de célula reina Negro (BQCV), 2- virus deformado ala (DWV)  y 3- virus de la parálisis aguda israelí (IAPV) [48]. Los controles positivos y negativos para cada virus se generan a partir de las existencias y de ejecución en cada RT-qPCR. Deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) y S18 (rps18) proteína ribosomal genes fueron utilizados como genes de referencia para la expresión de AChE y la detección de virus, respectivamente, en toda la RT-qPCR [49]. Genes de referencia fueron seleccionados después de muchos ensayos realizados en base a sus resultados exactos y la estabilidad en los tejidos de abejas inter e intra [49]. QScript One-Step kit SYBR Green RT-qPCR de Quanta-Bioscience se utilizó para realizar todo qPCR analiza tanto para la expresión de AChE y detección viral. El protocolo estándar de Quanta kit para toda la RT-qPCR se aplicó usando 2 l de 0,1 g de ARN purificado.

Infestación de ácaros Varroa

Cada colonia estudiada había sido equipado con un tablero inferior pegajosa para el recuento de ácaro varroa.Recuentos de ácaros varroa pasivos fueron hechas de este tablero cuatro veces para cada colonia durante el período de máxima actividad (agosto-septiembre), que coincide con la floración del maíz. Los recuentos de tablero inferior pegajosas se dejaron 72h y fueron utilizados para estimar diferencias en la abundancia varroa entre las colonias situadas en campos de maíz tratadas y no tratadas, así longitudinalmente a través de todas las colmenas. No hay tratamientos químicos para varroa fueron aplicadas durante el experimento.

Recopilación y análisis de polen

El polen se recogió de colmenas de cada apiario coleccionistas utilizando polen fijados en las entradas de las colmenas. El polen se recogió en diferentes momentos: antes (2-Agosto-12), durante (9-Agosto-12) y después del período de floración del maíz (23 de agosto y 6 de septiembre, 2012), (Tabla1). El polen recogido de las colmenas de cada lugar se agruparon, desecado a 37 ° C durante 48 horas y conservado a -20 ° C. Cada muestra seco se mezcla muy bien y 10 g de cada muestra se tomaron muestras al azar para la determinación de polen. Por cada 1 g de la muestra, el origen botánico de las cargas de polen se determinó con 2000 a 4500 granos de polen observados. La diversidad taxonómica de muestras de polen para cada fecha y localidad muestreada se determinó mediante la observación de la superficie total de diapositivas [50].

Detección de Pesticidas

La presencia de más de 150 pesticidas se evaluó en las abejas obreras en este estudio, así como en el polen, el método de flores de maíz y miel utilizando cromatografía líquida espectrometría de masas (LC-MS) [38]. El límite de detección LD para neonicotinoides es de 0,6 mg / kg para un límite de cuantificación LOQ de 2 g / kg [38]. Los análisis se procesaron en el laboratorio del Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de l'Alimentation du Québec (MAPAQ). Muestras de polen recogidos de las colmenas de cada apiario se agruparon después de la homogeneización completa. En total, se analizaron 16 muestras de polen de residuos de plaguicidas, así como los trabajadores de 12 abejas, la miel y 4 muestras de flores de maíz. Cinco gramos de cada polen, los trabajadores de abejas (50) abejas y la miel (2,5-3,0 ml de miel líquida) muestras fueron utilizados para la detección de pesticidas.

Condición Colmena

Dos principales parámetros fueron evaluados para medir la evolución biológica de cada colmena experimental: peso (kg) y el desarrollo de la cría de colonias [51, 52]. Un registro semanal se mantuvo del peso de la colmena durante el verano (marzo-junio), primavera (junio-septiembre) y estaciones de otoño (septiembre-diciembre) de 2012. Durante la invernada cubierta, se tomaron dos medidas (15 de enero y 26 de marzo , 2013). Para evaluar el desarrollo de la cría, todos los marcos de abejas que contienen celdas de cría coronadas fueron fotografiados dos veces al mes durante el período de actividad. Estimaciones Superficie de frecuencia de cría se consideran insuficientemente precisa, celdas de cría de los trabajadores tanto coronadas fueron contados por el manual que salpican utilizando el software Image J [53]. El total de las cubiertas de las células de los trabajadores contado para cada colonia refleja el número exacto de los huevos puestos por la reina en un momento determinado del ciclo de cría.

análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos para la expresión del gen ACE, los virus de la prevalencia (DWV, BQCV y IAPV), carga ácaro varroa, el desarrollo de la cría y el peso de la colmena para todas las colonias se realizaron utilizando lineales modelos de efectos mixtos [54]. Estos modelos se proporcionan en el paquete "lme4"  para una máxima probabilidad o restringidos de máxima verosimilitud (REML) parámetros de estimación y el "LmerTest"  paquete con el fin de realizar la prueba de razón de verosimilitud (LRT) y F-pruebas para al azar y factores fijos. Los análisis estadísticos se realizaron en diez y seis repeticiones biológicos independientes para cada tratamiento y cada fecha. Esos dieciséis repeticiones se técnicamente replicados tres veces para cada cuantificación RT-qPCR. Los análisis estadísticos relativos a la expresión de AChE de las colonias que han recogido polen de maíz se realizaron en cinco colonias (dos situados en tratados y tres en lugares no tratados) que fueron biológicamente replicados cinco veces para cada colonia.
Cada variable estudiada (expresión AChE, DVW, BQCV y IAPV prevalencia, carga varroa, cría y peso) se puso a prueba de normalidad con la prueba de Shapiro-Wilk [57]. Las variables no distribuidas normalmente se normalizaron para su distribución por transformación logarítmica. En los modelos lineales mixtos utilizados en los análisis estadísticos, el factor 'ubicación apiario "siempre se consideró como un factor aleatorio para evaluar cualquier efecto potencial de los diferentes lugares colmenar. Punto de tiempo de muestreo fue tratada como una 'medida repetida "y cuando se analizaron las variables de horas extras, la" fecha "factor fue tratado como un efecto fijo. Los modelos lineales mixtos se ajustaron por máxima verosimilitud y se utilizó la prueba t de Welch-Satterthwaite [58].
Las correlaciones entre las variables estudiadas y el factor de tratamiento se ensayaron usando los mismos modelos descritos anteriormente en las observaciones de horas extras y al permitir la interacción entre la variable. En los modelos lineales mixtos utilizados para generar las matrices de correlación, fecha en que se considera un factor fijo como datos de las horas extraordinarias se pusieron a prueba y la ubicación apiario como un factor aleatorio para evaluar bastante el efecto del tratamiento en el conjunto de datos. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo en el entorno R [59].

Resultados

Colonias fondo genético

Todas las colonias estudiadas han mostrado un (Q) patrón para su región intergénica ADNmt COI-COII. Por lo tanto, todos ellos pertenecen al linaje del Mediterráneo Norte (C).

Análisis de polen

Palinológico analiza para cada apiario en las cuatro fechas diferentes muestreados (2, 9, 23 de agosto y 6 de septiembre, 2012) (Tabla 1) reveló varios tipos de polen. Trifolium sp. (Fabaceae) era la flor más visitado (> 45%), seguido de Lythrum sp. (Lythraceae) en 12 a 45%. Varias especies de Solidago También se registraron (Asteraceae) en 15.3%. Maíz polen Z. Mays (Poaceae) fue identificado en cinco colmenas (R2, R8, R12, R24 y R26) a una gran cantidad de c. 1% del total (S1 Fig).

Expresión AChE

Los niveles de expresión de AChE para todas las muestras estudiadas se resumen en la Tabla2. El ΔΔ C T se calculó la media, así como la cantidad relativa de plantilla original (RQ), para las colonias situadas en campos tratados y no tratados por separado. P-valor muestra diferencias significativas para las expresiones dolor entre las colonias ubicadas en campos de maíz tratados y no tratados en las cuatro fechas de la muestra (Tabla2, Figura2a). Sin embargo, al comparar los niveles de AChE sólo para las colonias que han recogido polen de maíz, significativamente mayor expresión de AChE (T = 2,62; p = 0,01) se observó en el 23-Agosto-12, así como la expresión horas extraordinarias (T = 2,22; p = 0,02) para las colonias situadas en campos de maíz tratados en comparación con los de los no tratados (Tabla 2, Figura2B). Por último, en ambos campos tratados y no tratados, los niveles de expresión de AChE variaron significativamente entre las fechas de muestreo (T = 4,49; p <0 font="">

Tabla 2

Contrastes en la abundancia de patógenos abeja (DWV virus de las alas deformadas, reina negro BQCV virus de célula y varroa) y la expresión de AChE por fecha y el tratamiento de los neonicotinoides.
Campos tratados neonicotinoides (media / 16 colonias)Campos no tratados (media / 16 colonias)Tratamiento
ObjetivoΔΔ C TSERQΔΔ C TSERQT-valorValor P
DWV (1)5.450.140,0424.560.1920.07-0.850.44
BQCV (1)11,890.150,07310,830.170.28-0.430.68
AChE (1)1.150.180.541.030.230.53-0.360.71
AChE (1) única / Maíz Polen1.210.100.781.060.110.560.970.34
Varroa (1)------1.180.30
DWV (2)3.990.240.353.940.1395.57-0.080.92
BQCV (2)7.660.150.8412,750.160.042.850,007 **
AChE (2)0.630.170.800.670.140.73-0.260.79
AChE (2) solamente / Maíz Polen1.100.190.901.320.170.512.620.018 *
Varroa (2)------1.750.08
DWV (3)3.140.1561.59-0.050.15406.11-1.470.15
BQCV (3)7.460.130.1312,350.2503.130,003 **
AChE (3)0.860.130.620.870.120.610.040.96
AChE (3) solamente / Maíz Polen0.980.180.590.840.160.371.760.09
Varroa (3)------2.240.031 *
DWV (4)-2.780.182548.16-7.560.155388.73-1.430.22
BQCV (4)14,460.170,00218,200.2602.010.11
AChE (4)-0.140.121.140.100.111.040.490.64
AChE (4) solamente / Maíz Polen0.340.150.950.230.170.97-0.600.55
Varroa (4)------0.850.39
A través del tiempo
DWV-1.340.24
BQCV2.010.11
Dolor-0.080.93
Sólo AChE / Maíz Polen2.220.029 *
Varroa2.810.0056 **
(1), (2), (3) y (4) son las fechas de la muestra 13-Julio-12, 23-Agosto-12, 02-octubre-12 y 15-Enero-13 respectivamente.
ΔΔ C T es el ciclo umbral en las reacciones de qPCR, SE: los errores estándar de ΔΔ C T y RQ es la cantidad relativa de la plantilla de ARN en las muestras originales. Valor P es la probabilidad de RQ valor medio de la prueba t de Welch-Satterthwaite en modelos lineales mixtos entre las colonias ubicadas en neonicotinoides tratada y campos de maíz no tratadas. (-) Significa que no es aplicable.

a) Medios de la acetilcolinesterasa (AChE) expresión en cuatro fechas de todas las colmenas estudiadas, situada en tratados y los campos no tratados b) Medios de expresión de AChE en cuatro fechas de colonias que habían recogido polen de maíz: (R12 y R24) en el tratado y (R2 , R8 y R26) en los campos de maíz no tratadas. RQ es la cantidad relativa de la infección por el virus en las muestras originales, y las barras de error son los errores estándar (SE) de cada grupo estudiado. Valor P es * P <0 br="">

Infección por el virus

Investigaciones RT-qPCR para tres virus (BQCV, DWV y IAPV) no revelaron IAPV en las muestras analizadas. Sin embargo, BQCV y DWV han identificado en diferentes fechas. El nivel medio más alto de infección BQCV se registró al final del período de floración del maíz (23-agosto-12) para las colonias ubicadas en los campos tratados. Además los niveles de infección BQCV fueron significativamente mayores en colonias situadas en campos de maíz tratados (t = 2,85, p = 0,007 y T = 3,13, P = 0,003) que en las colonias de los campos de maíz no tratados para las fechas 2 y 3, respectivamente (Tabla2, Fig3) . DWV demostró un patrón diferente de la prevalencia de la infección a BQCV y alcanzó su punto máximo durante el invierno (15 de enero-13) para ambas colonias tratadas y no tratadas (Tabla2). No se observaron diferencias significativas entre colonias colocadas en los campos de maíz tratadas y no tratadas para DWV (T = -1,34, P = 0,24) (Tabla2).

Varroa abundancia de ácaros

Infestación de Varroa fue mayor en las colmenas ubicadas en los campos de maíz tratados en todas las fechas estudiadas (Figura4). Se observó que la media más alta de los ácaros varroa contadas en 6-Septiembre-12 en las colonias de los campos de maíz tratados con un valor de p significativo (t = 2,24, p = 0,031) (Tabla2, Figura4). A lo largo de las fechas, la carga varroa fue altamente significativa en las colonias de los campos de maíz tratados en comparación con las de las no tratadas (t = 2,81, P = 0,005) (Tabla2).
Fig 4
Los valores medios de la abundancia de ácaros varroa en las 32 colonias estudiadas, 16 colonias en cada campos de maíz tratados y no tratados en cuatro fechas diferentes.

Los análisis químicos

Residuos de plaguicidas detectables en el polen, las abejas adultas, miel y flores de maíz para cada fecha se resumen en la Tabla3. Pesticidas neonicotinoides no se detectaron en la muestra de miel de los cuatro apiarios en el 20-Sep-12. El tiabendazol, un fungicida, se detectó en todas las muestras de miel en concentraciones muy bajas (0,0004 a 0,0008 g / g). Entre las abejas adultas, no se detectaron pesticidas en ninguna de las muestras en cualquier punto de tiempo, a excepción de las muestras procedentes de apiario 3 en 13-julio-12, en los que se detectaron bajos niveles de atrazina (herbicida). Niveles muy bajos de carbaril (un insecticida) fueron identificados en algunas muestras de polen. No se detectó tiametoxam mientras clotianidina, un neonicotinoide -que pesticida es un metabolito de tiametoxam, fue identificado en las flores de maíz de los campos de maíz N ° 3 a baja concentración (0,0037 mg / g) (Tabla3, Figura1).
Tabla 3
Residuos de plaguicidas químicos analizados por (LC-MS) para la miel, abeja adulta, el polen y la flor de maíz a partir de los cuatro lugares estudiados en diferentes fechas.

Desarrollos de peso y de cría

Diferenciales significan Se calcularon los valores para ambos grupos de colonias: ubicados en campos de maíz tratados y no tratados (figura5a). El desarrollo total de peso fue significativamente más alto (T = 2,48, P = 0,01 y T = 2,36; p = 0,02) en las colonias de los campos de maíz tratados en dos fechas (17, 24 de octubre-12), respectivamente (figura5a). Ambos grupos mostraron el mismo peso durante el invierno desde el 31 de octubre-12 hasta el 15-Enero-13. A partir de 26-Marzo-13 en adelante, el grupo no tratado alcanzó un peso promedio mayor que el grupo tratado (figura5a). Desarrollo de la cría no mostró diferencias significativas entre los dos grupos tratados y no tratados en las cuatro fechas estudiadas (figura5b).
Fig 5
a) Diferencial peso de las colmenas significar valores de peso en los campos tratados y no tratados b) Trabajador de cría valores medios de los dos grupos estudiados (16 colonias en cada campos de maíz tratados y no tratados). Las barras de error son los errores estándar (SE) de cada grupo. ...

Correlación de patógenos tratos

El factor de tratamiento basado en el diseño de nuestro experimento refleja el contraste de las variables entre los 16 colonias de abejas colocados en dos áreas agrícolas distintos campos de maíz que contienen neonicotinoides tratados y otras 16 personas ubicadas en dos zonas campo de maíz orgánico. Las matrices de correlación generados a través de los modelos lineales mixtos, en expresiones de tiempo extra variable mostraron correlaciones significativas entre algunas variables y el factor de tratamiento, la figura 6 y S2 Fig.Como un par de correlación, correlaciones significativas (P = 0,02) se registraron entre el tratamiento y la expresión de AChE (r = 0,44), así como DWV (r = 0,39) y varroa (r = 0,3), Fig6. Además de que, una de correlación múltiple (P = 0,04) se detectó por tres patógenos (DWV, BQCV y varroa), estos patógenos correlacionaron significativamente con el factor de tratamiento (r = 0,29), la figura 6 y S2 Fig. No hay correlación fue grabado entre ambos cría y la evolución del peso y el factor tratamiento. Sólo correlaciones estadísticamente significativas (P <0 .05="" analizan="" el="" en="" font="" muestran="" se="" texto.="" y="">
Fig 6
Horas extraordinarias correlaciones significativas entre las variables estudiadas (AChE, DWV, BQCV y varroa) y el factor tratamiento.

Discusión

En los últimos 20 años, los neonicotinoides se han convertido en la clase más ampliamente utilizado de insecticida. Neonicotinoides Actualmente están permitidos en más de 120 países, en más de 1000 plantas diferentes [60]. La evidencia sugiere que la mayoría de los neonicotinoides son altamente persistentes en el agua, el suelo y los sedimentos [61]. Además, los neonicotinoides también se pueden acumular en el suelo después del uso repetido  lo que aumenta su absorción por los cultivos posteriores o plantas en los suelos contaminados. El estudio de la toxicidad de los plaguicidas para las abejas en el campo presenta retos importantes, especialmente cuando se trata de la toxicidad subletal.
Los cuatro apiarios que estudiamos en nuestro experimento se encuentran al suroeste de la ciudad de Quebec, en una zona dominada por el cultivo de maíz (Figura1). En los últimos años, diferentes niveles de mortalidad de abejas fueron reportados por los apicultores locales en la región. En el primer año de nuestro experimento, entre las 32 ​​colonias estudiadas (16 colonias por el tratamiento, la figura 1 y la tabla1), 2 colonias perecieron en los campos tratados, mientras que una colonia se perdió en un campo sin tratar. Aunque la muerte colonia podría estar relacionado con numerosos factores y no sólo para el uso de plaguicidas, esto sigue siendo una observación interesante. La causa de la muerte fue diferente entre las tres colonias. Los que están en los campos de maíz tratados murieron gradualmente después de un descenso notable en el número de huevos puestos por la reina, y también se registraron síntomas de las alas deformadas. Por el contrario, la colonia se encuentra en los campos de maíz no tratadas no mostraron ningún síntoma de la enfermedad y no pudo volver a la reina y murió en el comienzo del experimento.
Las comparaciones de la actividad AChE sobre todas las colonias no reveló diferencias significativas entre las colonias de abejas situadas en campos de maíz tratadas y no tratadas (Tabla2, Figura2A). Análisis palinológico reveló que entre los treinta y dos colonias estudiadas, cinco colonias habían recogido polen de maíz (R2, R8, R26: campos no tratados y R12, R24: campos tratados). Aunque el polen del maíz fue en menor concentración (1%) en comparación con otro estudio reciente (que van del 2,6% al 82,7%)  la expresión de AChE fue significativamente mayor en las colmenas de abejas colocados en dos campos de maíz tratados replicados (T = 2,62, P = 0,01) (Tabla2, Fig2b). Este resultado sugiere que la expresión de AChE significativamente elevados en las colonias ubicadas en los dos campos de maíz -que tratados produjeron concomitantemente con el período de floración (julio y agosto), la disminución en octubre-2012 (Figura 2b) -es muy probable que tengan un nexo causal con la presencia del polen de maíz recogidos de los campos de maíz tratados circundantes.Aunque se estableció una correlación positiva (P = 0,02, r = 0,44) entre el aumento de la AChE y el factor de tratamiento (Fig 6 y S2 Fig), espectrometría de cromatografía de masa líquida (LC-MS) no pudo detectar cualquier neonicotinoide en el analizado polen (Tabla3). Este resultado no es sorprendente porque en un extremo, la proporción de polen de maíz recogida por las abejas melíferas fue sólo 1%, y en las otras concentraciones, medidos de clotianidina en flores de maíz de apiario 3 fueron bajos (3,7 ng / g). Aunque no podemos excluir la probable contribución de otros factores en el aumento de la expresión de AChE, estos resultados son muy similares a los de  en el que sólo trace (1 ng / g) de los neonicotinoides resultantes de los tratamientos de semillas con insecticida fueron identificados en el polen recogido por las abejas.
Entre los tres virus estudiados, BQCV y DWV se identificaron a varios niveles en varias colmenas. IAPV, por otra parte, estaba ausente. La infección con BQCV fue significativamente mayor en las colmenas situadas en campos de maíz tratados inmediatamente después de la floración de maíz (Tabla2, Fig3). El ácaro varroa es un vector conocido del virus BQCV y otros patógenos que se encuentran en las abejas  - 67].Nuestros resultados mostraron niveles significativamente más altos de infección varroa en colonias situadas en campos de maíz tratados en comparación con los de los campos no tratados (Tabla2, Fig4). Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que las colonias de abejas colocados junto a los campos de maíz tratada neonicotinoides son sometidos a un mayor nivel de tanto la replicación viral y la carga de ácaros varroa.Mayor carga del ácaro varroa podría a su vez favorecer la transmisión viral de abejas [68]. El neonicotinoide activación de la replicación del patógeno viral se demostró que se produzca in vitro con dosis subletales [69].Por lo tanto, sigue siendo posible que alimentándose en campos de maíz tratados neonicotinoides deteriora la inmunidad abeja y disminuye su capacidad para controlar los patógenos de los diferentes colmena. Los agentes químicos que promueven la abeja susceptibilidad a los patógenos se han demostrado en estudios anteriores, sobre todo en un vínculo entre microsporidios (Nosema infección sp.) Y los pesticidas neonicotinoides [70]. Además, en nuestro estudio, puede-ser en gran medida el papel descontado dado fondo -que genética podría desempeñar un confusión que todas las colonias compartían similares ascendencia (Lineage C) y colmenas fueron asignados al azar entre los tratamientos. Este último parámetro se ha tenido en cuenta en todos nuestros análisis estadísticos considerando la 'ubicación apiario "como un factor aleatorio en los modelos lineales mixtos utilizados. Curiosamente, las correlaciones estadísticas realizadas en nuestro enlace conjunto de datos de nuevo el factor de tratamiento en una correlación positiva (P = 0,04, r = 0,29) con tres patógenos diferentes (DWV, BQCV y la infestación de varroa), Fig 6 y S2 Fig. Entonces esta correlación sugiere que la proximidad de las colonias de abejas a los campos de maíz tratados conducen a incrementos sutiles de estos patógenos. Los patógenos significativamente más altas (BQCV y de infestación de varroa), así como la expresión de AChE en las colonias de los campos de maíz tratados, evidenciado en nuestro estudio, pueden ser el resultado de un efecto de pesticidas indirecta en la salud de la abeja. Estas observaciones pueden ser el resultado de tanto una alteración del sistema higiénico de las abejas y la respuesta inmune [71, 72].
En cuanto a los dos rasgos biológicos (peso y cría) investigados en nuestro estudio, que no parecen ser claramente o directamente afectadas por el factor tratamiento in vivo. Aumento de peso Colonia (kg) reveló diferencias significativas entre las colmenas ubicadas en los campos de maíz tratados y los no tratados en dos puntos de tiempo solamente (17 y 24 de octubre, 2012) (figura5a). Sin embargo, el desarrollo de la cría no muestra diferencias significativas entre los grupos de las dos colmenas (tratados y no tratados), la figura5b.Curiosamente, el relativamente mejor ganancia de peso (17 y 24 de octubre de 2012) de las colmenas de tratamiento no se sigue con una mejor crianza (Fig (Fig5a5a y and5b), 5b), que indica que el aumento de masa se ​​debe a mejores miel y / o polen colecciones, no necesariamente para mejor tamaño de la colonia.En conclusión, parece que el tratamiento de semillas neonicotinoides tenía impactos sutiles en la cría de abejas y peso en las escalas temporales tratados en nuestro estudio. Datos similares se documentó en las abejas se alimentan en los campos de maíz y canola tratadas con clotianidina [73].

Conclusión

Nuestros datos muestran que las colonias de abejas colocados en campos de maíz tratados con semillas recubiertas neonicotinoides experimentaron significativamente más altas cargas del ácaro varroa, y mayor prevalencia BQCV que las colonias que se colocaron en los campos de maíz de control. Por otra parte, para las colonias que habían recogido el polen del maíz, los niveles de AChE fueron significativamente mayores en las abejas situadas en los campos de maíz tratados que los de los campos de maíz no tratadas. Aunque la expresión de AChE, así como BQCV, DWV e infección varroa se correlacionaron significativamente con el factor de tratamiento, no se detectaron neonicotinoides en los productos de la colmena de abejas, pero en las flores de maíz. Esto sugiere un efecto indirecto de los neonicotinoides en la salud de la abeja en los campos.Basada en anticuerpos tanto el acoplamiento de métodos más sensibles, como policlonal inmunoenzimático ensayo  con otros biomarcadores están fuertemente necesarios para proporcionar herramientas rápidas, eficientes y rentables para el control en el campo.

información de soporte

S1 figura

Granos de polen.
Grano de polen Diver identificado bajo la microscopía incluyendo granos de polen de maíz Z. Mays.
(PDF)

S2 figura

Salida de correlación.
Matrices lineales mixtos salida del modelo que muestran las diferentes correlaciones entre las variables y el factor tratamiento.
(PDF)

Expresiones de gratitud

Estamos muy agradecidos con el Conseil pour le Développement de l'Agricuture du Québec (cDAQ) que han financiado este estudio, así como al Centro de Investigación en Ciencias Animales de Deschambauls (CRSAD) por sus apoyos logísticos de valor incalculable en el campo y la Fédération des apiculteurs du Québec (FAQ) que apoyaron el proyecto. Los autores desean dar las gracias a Aysha Rahman por su contribución en el conteo de cría. También agradecemos al Dr. Martin Llewellyn y el Dr. Aziza Rahman para la revisión de este manuscrito y comentarios valiosos.

Declaración de Financiamiento

El donante se Conseil pour le Développement de l'Agricuture du Québec (cDAQ). Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

Disponibilidad de datos

Todos nuestros datos relativos a este estudio (ubicaciones colmenar, cría y contando varroa, la producción estadística R, RT-qPCR resultados en bruto) se cargan y accesible sobre LabArchives bajo el DOI: 10.6070 /H4CC0XPS.

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Fuente: http://www.plosone.org/

SI NO ACTUAMOS MORIREMOS MUCHOS EN LA RULETA GENETICA