Los cambios de comportamiento por infección de Nosema Ceranae

Los cambios fisiológicos y de comportamiento de las abejas (Apis mellifera) producidos por infección de Nosema ceranae 

Abstracto

La exposición continua a las plagas de ácaros, la mala alimentación, pesticidas y patógenos amenazar la supervivencia de la miel de abeja. En las colonias sanas, la interacción de la proteína precursora de la yema, la vitelogenina (Vg), y factor endocrino, hormona juvenil (JH), funciona como un marcapasos dirigir la secuencia de comportamientos que los trabajadores realizan a lo largo de sus vidas. Abejas jóvenes realizar trabajos de enfermería dentro de la colmena y tiene alta Vg y JH baja, como mayores transición abejas para alimentarse, esta tendencia se invierte. Los patógenos y parásitos pueden alterar esta red de regulación. Por ejemplo, la infección con el microsporidian, Nosema apis, se ha demostrado que avanzar la maduración de comportamiento en los trabajadores. Se investigaron los efectos de la infección con un patógeno miel de abeja reciente sobre los factores fisiológicos que subyacen a la división del trabajo en los trabajadores. Las abejas infectadas con N. ceranae eran casi dos veces más propensos a participar en alimentación precoz y vivió 9 días menos, en promedio, en comparación con los controles. También muestran que la transcripción Vg fue baja, mientras JH título de pinchos, en edad infectados por enfermeras abejas en jaulas. Este patrón de expresión es atípico y la inversa de lo que se esperaría para personas sanas y no infectadas abejas. La alteración de los fundamentos básicos de la polyethism temporal debido a una infección puede ser un factor que contribuye a la mortalidad reciente colonia alta, ya que los trabajadores pueden perder flexibilidad en su respuesta a las demandas de la colonia.

Cita: Goblirsch M, Huang ZY, Spivak M (2013) Los cambios fisiológicos y de comportamiento de las abejas (Apis mellifera) producidas por Nosema ceranae infección. PLoS ONE 8 (3): e58165. doi: 10.1371/journal.pone.0058165

Editor: Gro V. Amdam, Arizona State University, Estados Unidos de América

Recibido: 10 de agosto de 2012; Aceptado: 1 de febrero de 2013, Publicado: 06 de marzo 2013

Copyright: © 2013 Goblirsch et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y se acredite la fuente.

Financiación: Esta investigación fue financiada por el Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA) Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura (NIFA)-Coordinación Agrícola del Proyecto (CAP) subvención concedida a la EM y ZH y becas de investigación del norte de la Región Central de Investigación de Agricultura Sostenible y Educación (NCR-SARE) y la Sociedad Apícola del Este recibió a MG. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses.

INTRODUCCIÓN 

La importancia económica y ecológica de las abejas melíferas (Apis mellifera) como polinizadores de muchas plantas cultivadas y nativas convierten en un sistema importante para el estudio de los efectos de la enfermedad en el individuo y la colonia o niveles sociales. En los EE.UU. y en todo el mundo, se ha vuelto cada vez más difícil mantener las colonias de abejas vivas como son desafiados con numerosos factores que ponen en peligro su supervivencia.Plagas de ácaros, patógenos, plaguicidas, y las deficiencias nutricionales crear una combinación de circunstancias que pueden interactuar negativamente a poner en peligro la salud de la colonia [1] , [2] . Para el concreto de EE.UU., el resultado de esta crisis de salud ha habido pérdidas de casi un tercio de las colonias anualmente desde el año 2006 [3] . Este nivel recurrente de la muerte puede ser insostenible para la industria de la apicultura, y podría degradar el valor de los cultivos y otros productos que requieren polinización [4] .

Muchos patógenos y parásitos son comunes y generalizados en los no sintomáticos, o aparentemente sanas, colonias [5] . Esta carga hace hincapié en la capacidad de amortiguación de las sociedades de abejas, pero hace que sea difícil establecer con seguridad el impacto de un factor específico en la salud de la colonia. Afortunadamente, una gran cantidad de investigación disponible que describe los factores fisiológicos que influyen en la división basada en la edad de la mano de obra de los trabajadores dentro de las colonias sanas [revisado por: 6,7]. Nos basamos en este fondo de investigación para explorar los mecanismos que podrían interferir con la exposición siguiente trabajador comportamiento a un solo patógeno específico, Nosema ceranae, considerado como un factor en la disminución de colonias [1] .

La miel de abeja casta obrera muestra una división basada en la edad de los trabajadores. En el norte de climas templados, los trabajadores que emergen como adultos durante el verano viven 6 semanas en promedio. Tras la emergencia, los trabajadores de menos de 3 semanas de edad permanecen en la colmena como enfermeras, alimentar a las larvas ya la reina, o realizar el mantenimiento del nido. Alrededor de 3 semanas, los trabajadores de la transición de funciones de enfermería para alimentarse de néctar y polen fuera del nido. Una vez que la transición a los trabajadores a buscar comida, por lo general viven un período adicional de 2-3 semanas, con independencia de la edad en que se produce el cambio [8] . Para mantener la cohesión colonia, los trabajadores demuestran un nivel de flexibilidad al avanzar, retardar o revertir el desarrollo del comportamiento en respuesta a las necesidades de la colonia, como una pérdida de cazadores-recolectores de la depredación o confinamiento de cazadores-recolectores durante las inclemencias del tiempo [9] - [11] .

La proteína precursora de la yema, la vitelogenina (Vg) y el factor endocrino, la hormona juvenil (JH), se cree que son los reguladores fisiológicos subyacentes desarrollo de la conducta en los trabajadores de abejas [12] - [14] . Vitelogenina tiene múltiples funciones en la salud abeja de la miel, y es esencial para el desarrollo del óvulo, tiene la respuesta inmune y propiedades antioxidantes, y sirve como una reserva de nutrientes y vehículo lipídico [15] . Abejas nodrizas tienen una alta Vg en los tejidos corporales de grasa y bajo de JH en la hemolinfa, mientras que en el inicio de la búsqueda de alimento, las abejas más viejas tienen una baja Vg y JH alta[11] , [16] . La interacción regulatoria entre Vg y JH se ha demostrado experimentalmente en edad enfermera abejas utilizando ARN de interferencia, donde desmontables de expresión Vg produjo un aumento de JH título, el inicio rápido de forrajeo, y una menor esperanza de vida[17] . Además, la aplicación tópica de JH se ha demostrado que induce la alimentación precoz[18] .

Nosema ceranae es un hongo formador de esporas que infecta y se reproduce dentro de las células epiteliales del intestino medio. Durante el curso de la infección, millones de esporas son producidas y liberadas en el medio ambiente cuando una abeja defeca. Estas esporas son una fuente de infección para otras abejas. Para una colonia que contiene miles de trabajadores, la infección y la muerte prematura de una abeja puede ser una pérdida insignificante. Sin embargo, como la infección se extiende a un gran número de abejas un efecto cascada, podría derivarse de desafiar supervivencia de la colonia: a medida que la población infectada muere, la reina puede ser incapaz de poner los huevos suficientes para reemplazar la pérdida, y los restantes trabajadores pueden perder flexibilidad en su comportamiento desarrollo para responder a la demanda de la tarea.

Los estudios que detallan los efectos patológicos de N. ceranae en los trabajadores individuales se han centrado principalmente en las consecuencias de la mortalidad [19] , [20] .Algunos estudios han examinado los efectos de la infección sobre la expresión de péptidos relacionados con la inmunidad [21] , [22] o observaron los cambios en los estados nutricionales o energético [23] , [24] . Sin embargo, nuestra comprensión de los efectos fisiológicos subyacentes que contribuyen al proceso de la enfermedad es incompleta. Por otra parte, los estudios de comportamiento que vinculan los cambios observados en la fisiología de las abejas infectadas faltan y ayudaría a determinar los efectos de acogida y / o adecuación colonia. Hemos observado abejas infectadas con N. ceranae en las colonias de campo para establecer la edad de inicio de forrajeo. Luego midieron las respuestas fisiológicas, específicamente VG y JH, de abejas infectadas en jaulas y colonias de campo. Se utilizó QRT-PCR y un radioinmunoensayo para medir la relación Vg transcripción en los tejidos y títulos JH en la hemolinfa, respectivamente. Nuestro objetivo fue determinar si la infección con N. ceranaealtera procesos fisiológicos fundamentales que subyacen ancestrales características reproductivas que las abejas cooptada como un mecanismo para controlar el comportamiento social [11] , [13] .

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

No hay permisos específicos se requiere para los estudios de campo descritos. Las observaciones se llevaron a cabo en la Universidad de Minnesota apiario, por lo tanto, no se requiere permisos específicos para esta ubicación. El apiario es propiedad de la Universidad de Minnesota y no de propiedad privada o protegida de alguna manera. Los estudios de campo involucrado observando la miel de abeja europea (Apis mellifera), que no es una especie en peligro de extinción o protegidas.

Purificación Spore

Nosema ceranae esporas se adquirieron para estudios de infección por purificación Percoll.Brevemente, las abejas se recogieron y se anestesiaron en hielo a partir de una colonia se sabe que contienen los individuos infectados con Nosema sp. tal como se determina por microscopía. El tracto alimentario fue retirado de un número suficiente de abejas para asegurar una gran fuente de inóculo. Los tubos digestivos se agruparon en un tubo estéril de 50 ml cónico que contenía 15 ml de agua estéril y se homogeneizó utilizando un homogeneizador de tejidos Polytron (Brinkmann Instruments, Westbury, NY). El homogeneizado se pasa a través de un filtro de gasa para eliminar los restos y después se llevó a un volumen de 40 ml con agua estéril. La suspensión se centrifugó a 1500 g durante 10 min a 4 ° C. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió por agitación en 40 ml de agua estéril, seguido de centrifugación a 1500 g durante 10 min a 4 ° C. Esta etapa se repitió 2 veces. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió por agitación en 20 ml de Percoll% 100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ajustado a un pH de 7,0 con 1 N HCl. La suspensión se centrifugó a 2500 g durante 30 min a 4 ° C. La columna de Percoll se retiró cuidadosamente y se desechó y el sedimento se lavó una vez con 5 ml de agua estéril. El sedimento final se resuspendió en agua estéril y se almacenó a 4 ° C hasta su uso. Confirmación de las especies se realizó mediante PCR convencional utilizando los cebadores descritos previamente [25] .

La inoculación de las abejas

Los marcos de cría de obreras, fueron retirados de las colonias que no presentan síntomas, conocidos aparentes de enfermedad, y se incubaron durante la noche a 32 ° C y 70% de humedad relativa (RH). El día siguiente, las abejas que habían surgido se obtuvieron de marcos dentro de 24 h después de la eclosión. Cada abeja que iba a ser inoculado se contuvo entre el pulgar y el dedo índice por el personal del laboratorio y se administran por vía oral 10 ⁴ N.ceranae esporas en 5 l de solución de sacarosa (50% w: v) o un volumen igual de solución de sacarosa sin esporas utilizando micropipetas. Las abejas se llevaron a cabo individualmente en viales de 20 ml después de la inoculación durante ≥ 20 minutos para asegurar el inóculo se ingiere. Las abejas que no consumieron el inóculo se descartaron.

La mortalidad de Evaluación

Las abejas se inocularon dentro de 24 h después de la eclosión como anteriormente y se puso en 11 × 11 × 11 cm jaulas según el grupo experimental a lo largo de 30 con pintura marcado un-inocularon abejas para proporcionar la interacción social y sirven como controles que recibieron una mínima manipulación. Las jaulas se colocaron en una cámara oscura ambiental mantenida a 28 ° C y 70% RH. Las abejas se les dio acceso ad libitum a la solución de sacarosa al 50% y agua suministrada en los alimentadores por gravedad, y 5 g MegaBee proteína patty (Dadant & Sons, Inc., Hamilton, IL) colocado en un barco de pesar. Las jaulas eran rotados diaria para minimizar los efectos de posición, y sacarosa, agua, y Patty proteína fueron reemplazados semanalmente. La mortalidad en cada jaula fue grabado y abejas muertas fueron retirados todos los días. Tres jaulas en paralelo de 30 abejas, excepto jaula 3 del grupo infectado que contenía 33 abejas, se ensayaron para determinar las condiciones tanto infectadas como control. Los resultados de mortalidad se presentan como el porcentaje de supervivencia media diaria.

Observaciones del Comportamiento

Para determinar si la infección conduce a la búsqueda de alimento precoz, las abejas se inocularon en 24 horas después de la eclosión con 10 ⁴ N. esporas ceranae o la solución de sacarosa que el anterior, excepto el ensayo 2, donde las abejas infectadas por Nosema-recibió10 ⁵ esporas por abeja. Las abejas eran de pintura marcado para identificar el tratamiento y se introdujo en las colonias de campo que contienen una reina ponedora y marcos 5 empató para cría, alimentación y adultos. Cien abejas por tratamiento se introduce en cada uno de 8 colonias de campo de ensayo 1 y 2 y cada una de las 10 colonias de campo de ensayo 3. Por lo general, la transición de las abejas de la colmena en las tareas para el comportamiento de forrajeo a las 3 semanas de edad, por lo tanto, el comportamiento de búsqueda de alimento se observó diariamente desde las 7 hasta los 21 días de edad, que se consideró como la ventana precoz para este comportamiento. Forraje se observó durante una sesión de observación de 30 min al bloquear las entradas de colonias con tela metálica de malla 8 y el registro de todas las abejas marcadas de pintura que se devuelven. Sólo pintar las abejas marcadas con cargas de polen en su corbículas fueron considerados como cazadores-recolectores. Recolectores marcados se eliminaron en apariencia, pero no de otras abejas marcadas mostrando evidencia de forrajeo no fueron recogidos y pueden haber sido contados en días posteriores. El ensayo se llevó a cabo a través de forrajeo tres ensayos, dos veces en 2010 (julio y agosto) y una vez en 2011 (julio).

Recogida de muestras para las mediciones fisiológicas

Las abejas recibieron 10 ⁴ N. esporas ceranae o la solución de sacarosa dentro de 24 h después de la eclosión como anteriormente y se colocaron en jaulas que contienen pintura marcados abejas que no fueron inoculados para proporcionar una interacción social. Abejas Un-inoculadas eran miembros de la misma cohorte inoculadas como las abejas, pero recibió una mínima manipulación. Ocho jaulas en paralelo que contienen 120 inoculado y sin inocular 80 abejas por jaula fueron establecidos por tratamiento. Las abejas muertas se retiraron periódicamente y las jaulas se mantuvieron como anteriormente.

A las 4, 8, 12, y 16 días de edad, 8-10 abejas fueron seleccionados al azar y se retira de cada jaula. Abejas seleccionados fueron agrupados por jaula en 15 mL de tubos cónicos estériles sobre hielo para inducir la anestesia. Abejas anestesiadas fueron inmovilizados y ≥ 1 l de hemolinfa se obtuvo de cada abeja por la perforación de la membrana intersegmental entre los tergitos abdominales segundo y tercero y hemolinfa elaboración por acción capilar usando un Wiretrol Drummond (Drummond Scientific Company, Broomall, PA). La hemolinfa se descargó en un tubo de vidrio de 12 × 125 mm con tapa revestida con teflón que contiene 500 l de acetonitrilo enfriado y almacenado a -20 ° C hasta su análisis JH. El aparato de la picadura y como mucho del tracto alimentario adjunta como sea posible se eliminó por sujetándola con los fórceps y alejándose de los segmentos abdominales terminales. El aparato de la picadura y los tejidos fijos alimenticios se colocaron en 1 ml de agua estéril en un tubo de microcentrífuga y se mantuvo a 4 ° C hasta que la inspección de las esporas por microscopía.A continuación, la cabeza fue cortada y desechada, y la carcasa restante se puso en un tubo de microcentrífuga y flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis Vg.

Para comparar los niveles de Vg y JH abejas infectadas en comparación con el control en condiciones naturales, un adicional de 80 abejas por tratamiento se introduce en cada una de las 10 colonias de campo que contienen una reina y una cantidad igual de cría, alimentación y adultos. Colonias de campo fueron los mismos que los utilizados en la prueba 3 para observaciones de forrajeo. Las abejas fueron inoculados con 10 ⁴ N. esporas ceranae o sacarosa dentro de 24 h después de la eclosión como marcas de pintura mencionados y dado para permitir la identificación por el tratamiento. A los 7 y 15 días de edad, 4 abejas por tratamiento se recogieron sobre hielo de cada colonia. Las abejas se procesaron para el estado de infección, hemolinfa recogida, y el procesamiento de tejido como anteriormente.Sólo las abejas a partir del grupo Nosema-infectada que mostró la presencia de esporas en los homogeneizados intestinales por microscopía fueron utilizados para Vg y análisis JH ( Tabla 1). Ausencia de esporas en los homogeneizados intestinales de los controles de sacarosa también se confirmó mediante microscopía antes de análisis adicional para Vg y JH.

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Tabla 1. Número medio de esporas por abeja (× 10 ⁶⁾ a diferentes edades después de la eclosión de las abejas utilizan para Vg JH y análisis de los estudios de la jaula y de campo.

doi: 10.1371/journal.pone.0058165.t001

Radioinmunoensayo para cuantificar JH

A quiral radioinmunoensayo específico se utilizó para cuantificar título JH en la hemolinfa obtenida de las abejas individuales [16] . Un mL de hexano y 0,5 ml de NaCl al 0,9% se añadieron a las muestras y se centrifugaron a 2000 g durante 10 min. La fase de hexano que contiene JH se transfirió a un nuevo tubo. Este proceso se repitió para aumentar la eficacia de la extracción. El hexano se evaporó utilizando un sistema de secado Savant (Thermo Fischer Scientific, Inc., Pittsburgh, PA). Las muestras secas se enfrió en hielo y se lavó con 100 l de metanol mediante agitación en vórtex. Una parte alícuota de 10 l se transfirió a un nuevo tubo y el metanol se evaporó. A continuación, 200 l de premezclado JH antisuero (1:28,000) y DPM 10.000 [10-3H (N)]-JH (Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA) se añadieron a los tubos. Los tubos se incubaron durante 2 h, cuando radiomarcado JH y JH en la hemolinfa compitió por la unión al anticuerpo. La reacción se redujo enfriando los tubos en agua helada durante 10 min. Para absorber sin consolidar JH, las muestras se incubaron en 500 l de carbón revestido de dextrano durante 2,5 min. Los tubos se centrifugaron a 2000 g durante 3 min para sedimentar el carbón vegetal. El sobrenadante que contiene obligado JH se decantó en 20 mL viales de centelleo y 5 ml de cóctel de centelleo Ultima Gold (Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA) se añadió. La radiactividad se cuantificó y los valores se evaluaron frente a las normas ajustadas por regresión no lineal. Las muestras se analizaron por duplicado. El material de vidrio se horneó a 500 º C durante 3,5 h antes de su uso para minimizar la adsorción JH, y todos los reactivos fueron de grado HPLC. El antisuero JH fue proporcionada por David Borst (Central Florida University).

QRT-PCR para la expresión génica relativa Vg

ARN total fue extraído utilizando un kit RNAqueous (Ambion, Austin, TX) para estudios de jaula o método de Trizol para estudios de campo. Contaminación de ADN fue degradado con 10 U de ADNasa I (Ambion, Austin, TX) a 37 ° C durante 1 h seguido por 75 º C durante 10 min. Se sintetizó el ADNc mediante la incubación de 8 l con ARN total de mezcla maestra que contiene 50 U de transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA), 20 U RNaseOUT inhibidor de la ribonucleasa (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 dNTPs mu M, 2 nM poli (dT) ₁₈ , y 0,1 nM de poli (dT) _12-18 a 42 ° C durante 50 min seguido por 15 min a 70 ° C como se describe anteriormente [26] .

Transcripción se ensayó por qPCR. Dos l de ADNc sirvió como molde en una reacción que contenía 1 U de polimerasa Taq, 1 x tampón, 1 mM de dNTPs, 2 mM de MgCl _2, 0,2 M de adelante (5'-agttccgaccgacgacga-3 ') e inverso (5'-ttccctcccacggagtcc- 3 ') primers (entrada GenBank: NP_001011578) específicos para la amplificación del gen de la abeja de la miel precursor Vg, y 1 × SYBR-Green (Applied Biosystems, Foster City, CA) para un volumen total de 25 mL. Las reacciones se realizaron utilizando un perfil térmico que consiste en 95 ° C durante 30 segundos, seguido por 40 ciclos de un protocolo que consiste en 4-pasos de 95 ° C durante 20 s, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 1 min, y 78 ° C durante 20 segundos. Las medidas de fluorescencia se tomaron varias ocasiones durante el 78 º paso c. Una curva de fusión 3-etapa se realizó para asegurar una amplificación adecuada del gen diana. El gen de referencia, β - actina, se amplificó con adelante (5'-ttgtatgccaacactgtccttt-3 ') e inverso (5'-tggcgcgatgatcttaattt-3') primers (entrada GenBank: NC_007076) para normalizar los datos de acuerdo con el ARN cantidad en cada muestra. Todos los primers fueron publicados previamente y validado experimentalmente [26] , [27] .

Los análisis estadísticos

Los datos fueron analizados utilizando la versión 2.13.0 R (13/04/2011) software estadístico con el paquete de coche. Los datos de mortalidad se analizaron mediante el modelo de regresión de Cox de riesgos proporcionales con el paquete de splines. Las diferencias en el número de devolución de forraje polen marcadas se analizaron mediante prueba de ji cuadrado.Las diferencias en la transcripción y Vg título JH fueron analizados por ANOVA modelo mixto con el paquete nlme. El estado de infección y la edad de las abejas se modelaron como efectos fijos y jaula o una colonia de origen se modelaron como efectos aleatorios. JH datos fueron logaritmo natural transformado para satisfacer las hipótesis de una distribución normal de los residuales y estabilizar las varianzas. Todas las pruebas estadísticas utilizadas α = 0,05 para establecer la significación. Los datos se presentan como medias ± SE.

Resultados

Las abejas infectadas tienen una vida más corta comparada con los controles

Nosema ceranae tuvo un efecto negativo en la vida útil (z = 3,97, n = 363, p <0 1="" igura="" span="" style="background-color: transparent;">). Infección aumentó la mortalidad diaria por un factor de 1,99. La supervivencia fue superior al 75% e indistinguibles entre abejas infectadas y el control de 1 a 14 días de edad. Sin embargo, el número de supervivientes abejas infectadas caído por debajo de 50% en 16 días de edad, mientras que los controles no alcanzó este nivel hasta 25 días de edad. Por lo tanto, la mayoría de las abejas de control vivían, en promedio, 9 días más que las abejas infectadas.

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Figura 1. Nosema ceranae acorta la vida útil de abejas.

La media de supervivencia (%) de abejas enjaulados alimentado 10 ⁴ N. esporas deNosema ceranae (infectado) o la solución de sacarosa (control de sacarosa) en el día 0 (es decir, dentro de 24 h después de la emergencia de los adultos). Emparejados por edad compañeros de jaula que no fueron inoculados recibido manejo mínimo y se colocan en jaulas infectadas (Nosema cagemate) o control (cagemate Sacarosa) para simular la interacción social. n = 30 abejas por tratamiento / jaula (excepto jaula 3 en el grupo de pacientes infectados que contaba con 33 abejas), 3 jaulas de réplica por tratamiento. La infección tiene un efecto negativo importante en la vida útil (z = 3,97, n = 363, p  <0 10.1371="" doi:="" journal.pone.0058165.g001="">

Para dar cuenta de la mortalidad asociada con el manejo durante la inoculación, un adicional de 30 abejas que han recibido una mínima manipulación se pusieron en cada jaula (es decir, un-inoculadas compañeros de jaula). Mortalidad diaria fue significativamente mayor para las abejas que recibieron el manejo durante la inoculación en comparación con no-inoculados compañeros de jaula (z = 4.46, n = 363, p = 0,11).

La infección con N. Resultados ceranae en la eyaculación forrajeo

Un mayor número de infectados abejas marcadas en comparación con los no infectados abejas marcadas se registraron en las entradas a las colonias de campo a partir de 7 a 16 días de edad ( Figura 2A ). Había ≥ 30 abejas marcadas grabados en 13 de 15 días para el grupo de pacientes infectados en comparación con sólo 2 de 15 días para los controles. En total, fueron 206, 79 y 261 abejas marcadas (total = 546) registrados en el grupo de pacientes infectados en comparación con 130, 64, y, 151 abejas marcadas (total = 345) para los controles de sacarosa para los ensayos 1, 2 y 3 respectivamente ( Tabla 2 ).

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Figura 2. Las abejas infectadas con N. ceranae forraje antes de tiempo. A.

Distribución de devolver las abejas marcadas durante un período de observación de 30 minutos todos los días desde las 7 hasta los 21 días de edad después de la eclosión.Los datos se resumen en 3 ensayos independientes. B. Distribución de volver recolectoras de polen marcados recolectaron diariamente durante un período de observación de 30 minutos desde las 7 hasta los 21 días de edad después de la eclosión. Los datos se resumen más de 3 ensayos independientes. Recolectoras de polen significativamente más marcadas se recogieron entre el grupo Nosema-infectadaen comparación con los controles para los 3 ensayos combinados (χ ² = 26,38, p<0 i="" nbsp="">doi: 10.1371/journal.pone.0058165.g002

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Tabla 2. El número de devolución de las abejas marcadas, y de ellos, como el número de recolectoras de polen observados en las entradas a las colonias de campo durante 30 min diarios observaciones para 3 ensayos independientes.

doi: 10.1371/journal.pone.0058165.t002

Se desconoce si todas las abejas que regresan marcadas estaban comprometidos en búsqueda de alimento, por lo tanto, sólo las abejas que transportan cargas de polen se registraron como forraje para el siguiente análisis. La distribución muestra que hubo ≥ 10 recolectores registrados en 8 de 15 días para el grupo de pacientes infectados en comparación con sólo 1 de los 15 días para los controles. Las recolectores del grupo infectado superaron los controles en casi 2 a 1 para cada ensayo y se combinaron los tres ensayos. En total, fueron 73, 29 y 51 recolectores (total = 153) para el grupo de pacientes infectados en comparación con el 38, 15 y 23 recolectores (total = 76) para los controles de sacarosa para los ensayos 1, 2 y 3, respectivamente. Chi-cuadrado análisis mostró un número significativamente mayor de forraje fueron recogidos del grupo de pacientes infectados por ensayo 1 (χ 2 = 11,19, p = 0,0008), el juicio 2 (χ 2 = 3,95, p = 0,047), el juicio 3 (χ 2 = 10.23, p= 0,0014), y los 3 ensayos combinados (χ 2 = 26,38, p< 0,0001) en comparación con los controles. Para el ensayo 2, todas las colonias fueron inspeccionados en los días 4, 12 y 21 después de la introducción de la pintura marcadas y las abejas se observó que hubo un número relativamente iguales de abejas de ambos grupos de tratamiento actuales. Por lo tanto, suponemos que las abejas no infectadas control no mueren a un ritmo más rápido que las abejas infectadas por Nosema-durante las pruebas de campo, que está de acuerdo con nuestra evaluación de la mortalidad.

La infección tiene un efecto negativo en el expediente académico Vg en el tiempo para las abejas en jaulas, pero no las condiciones de campo

Hubo una interacción significativa entre el estado de la infección y la edad de las abejas en relación Vg transcripción de las abejas criadas en jaulas (F ₃₁₉₁ = 3,04, p = 0,030; Figura 3A ).Abejas de control mostraron una normalidad para el perfil de Vg trabajador adulto ontogenia[11] : niveles relativos alcanzaron un máximo de 8 días de edad y luego disminuye linealmente a través de los 16 días de edad infectadas por Nosema abejas mostraron la tendencia opuesta:. niveles relativos fueron bajas a las 4 y 8 días de edad con una disminución de 1,9 veces y 3,5 veces en la Vg, respectivamente, en comparación con las abejas de control.Después del día 8, los niveles Vg aumentó linealmente para las abejas infectadas. A los 16 días de edad, las abejas infectadas tenían un aumento de 3,3 veces en relación Vg comparación con los controles emparejados por edad. Los principales efectos de la edad o el estado de infección de abejas en relación transcripción Vg no fueron significativas (p> 0,05).

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Figura 3. Nosema ceranae altera la fisiología miel de abeja comportamiento. A.

Vitellogenin transcripción normalizada con el gen de referencia, β-actina, (media ± SE) para enjaulados abejas alimentadas con esporas de N. ceranae (Nosema infectado) o la solución de sacarosa (sucrosa de control) en el día 0 (es decir, dentro de las 24 horas después de la emergencia de los adultos) . n ≥ 17 tratamientos por persona y día. Hubo una interacción significativa entre el estado de la infección y la edad de las abejas en relación transcripción Vg (F ₃₁₉₁ = 3,04, p = 0,030). B. JH título (media ± SE) para enjaulados abejas alimentadas con esporas de N. ceranae (Nosema infectada) o solución de sacarosa (control de sacarosa) en el día 0 (es decir, dentro de 24 h después de la emergencia de los adultos). n ≥ 20 tratamientos por persona y día. El efecto de la interacción del estado de infección por JH título con el tiempo no fue significativa (F ₃₂₁₂ = 2,00, p = 0,11).

doi: 10.1371/journal.pone.0058165.g003

Los niveles de relación Vg para las abejas infectadas procedentes de colonias de campo no eran diferentes de los controles (F _1,80 = 0,22, p = 0,64; Figura 4A ). Sin embargo, hubo un efecto de la edad de las abejas en la transcripción Vg (F _1,80 = 4,91, p = 0,030). Como sería de esperar, los niveles de Vg disminuyó con la edad de los trabajadores. Transcripción abundancia fue comparable entre los controles (-1,32 unidades VG) y las abejas infectadas (-1,09 unidades VG) a los 7 días de edad, pero disminuyó en 1,4 veces y 2,2 veces, a los 15 días de edad, respectivamente. No hubo interacción entre el estado de la infección y la edad de las abejas en relación transcripción Vg (F _1,80 = 0,80, p = 0,37).

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Figura 4. Las abejas infectadas con N. ceranae han elevado JH título en condiciones de campo. A.

Vitellogenin transcripción normalizada con el gen de referencia, β-actina, (media ± DE) para las abejas alimentadas con esporas de N. ceranae (Nosema infectado) o una solución de sacarosa (sucrosa de control) en el día 0 (es decir, dentro de las 24 horas después de la emergencia de los adultos) y colocado en colonias de campo. n ≥ 22 tratamientos por persona y día. No hubo un efecto significativo de interacción N.infección ceranae en relación transcripción Vg en el tiempo (F _1,80 = 0,80, p = 0,37). B.JH título (media ± DE) para las abejas alimentadas con N. esporas de Nosema ceranae (infectado) o la solución de sacarosa (control de sacarosa) en el día 0 (es decir, dentro de 24 h después de la emergencia de los adultos) y se coloca en colonias de campo. n ≥ 31 por tratamiento por día. El efecto del estado de infección por el título de JH fue marginalmente significativa (F ₁₁₁₉ = 3,81, p = 0,053).

doi: 10.1371/journal.pone.0058165.g004

Cambio en JH título en hemolinfa de las abejas en jaulas y las condiciones de campo

La infección no mostraron un efecto sobre JH título de abejas en jaulas (F 1,14 = 0,47, p = 0,51). Sin embargo, las abejas infectadas tenían un aumento de 1,4 veces en el título de JH, en promedio, en comparación con los controles a través del curso de tiempo del estudio (Figura 3B ). La tendencia de las abejas a partir del grupo de pacientes infectados revelaron un aumento en JH título en las abejas de 8 días de edad (1580,18 ng / ml), que se registró un aumento de 2,1 veces en comparación con el nivel medio de control para las abejas de 8 días de edad ( 750,09 ng / ml). Título de la hormona juvenil mostró una disminución lineal de 8 días de edad hasta los 16 días de edad para el grupo infectado. En contraste, JH título se mantuvo estática en todo el curso de tiempo para las abejas de control. Las abejas de más de 16 días de edad no se recogieron, por lo tanto, se desconoce si JH título para los controles habría sido elevada como se predijo por los trabajadores ≥ 3 semanas de edad [11] . No hubo un efecto significativo de la edad sobre JH título (3,212 F = 8,22, p<0 nbsp="">

Abejas infectadas en las colonias de campo tuvo un aumento de casi tres veces en promedio JH título de comparación con los controles ( Figura 4B ), esta diferencia fue marginalmente significativa (F = 3,81 1,119, p = 0,053). Hormona juvenil fue bajo para las abejas infectadas y de control a los 7 días de edad, pero las abejas infectadas tenían un aumento de 2,2 veces en el título de JH en la hemolinfa (34,10 ng / ml) en comparación con los controles de la misma edad (15,67 ng / ml). Título de la hormona juvenil para las abejas infectadas aumentó bruscamente a los 15 días de edad y fue de 2,9 veces mayor que controles pareados por edad.No hubo una diferencia significativa en JH título entre las abejas de diferentes edades en colonias de campo (F 1119 = 100,21, p< 0,0001). Como sería de esperar para los trabajadores de edad, las abejas 15-días de edad promedio de un aumento de 12,7 veces en comparación JH título a 7-días de edad abejas. La interacción entre el estado de la infección y la edad de las abejas en JH título no fue significativa (F ₁₁₁₉ = 0,95, p = 0,33)..

Discusión

Nosema ceranae es un patógeno común y generalizada de las abejas en los EE.UU. y en todo el mundo [28] , [29] . En este informe, demuestran que N. ceranae puede desencadenar la eyaculación forrajeo y acortar la vida útil de los trabajadores infectados. También muestran que la transcripción Vg fue baja, mientras JH título de pinchos, en edad infectados por enfermeras abejas. Este patrón es atípico y lo contrario de lo que se esperaría para sanos, no infectados por las abejas. En las abejas melíferas, la transición de la enfermería en el interior del nido de cría para alimentarse fuera de la colmena se piensa que es objeto de control reglamentario a través de la interacción de la proteína precursora de la yema, Vg, y el factor endocrino, JH [9] .Esta interacción sirve como un mecanismo fisiológico subyacente que es esencial para permitir que la plasticidad de las respuestas de comportamiento a los trabajadores por colonia dinámico y ambientes ecológicos [7] . En infectadas por Nosema abejas, este marco normativo está aparentemente interrumpido.

En nuestro experimento el examen de los efectos de la infección en la vida útil, se encontró que los controles vivieron, en promedio, 9 días más largo que las abejas infectadas. Durante los meses de verano, una abeja obrera típica vive 3-6 semanas [30] , con las últimas 2-3 semanas dedicadas a la búsqueda de alimento [8] . Suponiendo que hay una tasa de mortalidad similar debido a la infección en las colonias de campo, reduciendo la vida útil trabajador por 9 días, especialmente durante la fase de búsqueda de alimento, puede ser significativo. Cualquier néctar y / o polen que se habría recaudado por la abeja infectada durante estos 9 días de vida se perdería. Por otra parte, si la abeja infectada fue parte de la fuerza de forrajeo de la colonia que realiza la exploración de comportamiento para nuevos parches florales [31] , la pérdida podría verse agravado como información detallada sobre la ubicación del parche no se comunicarían.

Los parásitos pueden acelerar o retrasar el desarrollo de acogida como una estrategia que aprovecha los recursos de acogida y maximiza la transmisión [32] . Alargar el desarrollo inmaduro de los ejércitos de insectos se ha demostrado con otras especies de Nosema. [33] ,[34] . En contraste, nuestros resultados sugieren que N. ceranae acelera el desarrollo de miel de abeja de comportamiento. Se observó un mayor número de abejas infectadas fuera del nido y comprometidos en forrajeo comparación con los controles. Evidencia de otros estudios han demostrado cambios anatómicos o de comportamiento que son congruentes con el desarrollo acelerado resultante de la infección con un patógeno similar, N. apis. Las abejas infectadas con N. apis se encontró que tienen un tamaño reducido y la función de las glándulas hipofaríngeas, que secretan un medio rico en proteínas que se alimentan las larvas de las enfermeras a [35] , [36] . Además, las abejas infectadas con N. apis se ha demostrado que tienen una menor esperanza de vida, y era más probable que se encuentre en la entrada del nido participan en la vigilancia, o fuera del nido realizando vuelos de orientación o comportamiento de forrajeo [37] - [40] .

Además de los cambios en la tasa de aparición de forrajeo, nuestros datos muestran que la infección puede alterar la fisiología subyacente que regula la expresión específica de la edad de los comportamientos de los trabajadores. La tendencia en los niveles de Vg y JH mostró una relación inversa: cuando Vg relativa transcripción estaba en su punto más bajo, JH título fue en sus más altos y vice versa para las abejas infectadas en jaulas. Esta conclusión está de acuerdo con investigaciones que muestran cómo Vg y actúan a través de retroalimentación positiva JH bucles de afectar negativamente la síntesis de cada uno para regular la expresión específica de la edad de lactancia o forraje comportamientos [41] . En nuestros estudios de la jaula, de edad infectados por enfermeras abejas tenían un título elevado de JH que alcanzó un máximo de 8 días de edad. Esta conclusión se ve corroborada por un reciente estudio que mostraron mayores niveles de JH en las abejas infectadas con N. ceranae en comparación con las abejas infectadas con N. apis o los controles no infectados [42] . También vimos una interacción entre la infección y la edad de las abejas en relación transcripción Vg, sin embargo, el efecto principal de N. ceranae en los niveles de infección Vg no fue significativa para las abejas o colonias en jaulas de campo. Este hallazgo es similar a un informe reciente que mostró transcripción Vg ser infección sin cambios siguientes con N. ceranae [21] .Nuestro descubrimiento puede sugerir la relación inhibitoria estricta que existe entre Vg y JH puede ser un ejemplo de cómo un patógeno puede desacoplar normalmente correlacionados síndromes conductuales mediante la interrupción de la fisiología subyacente [43] .

Hemos visto una considerable variabilidad en los niveles de transcripción relativa Vg y el título de JH en nuestros experimentos de la jaula. De hecho, si la jaula de origen se modeló como un efecto fijo en el ANOVA, un efecto significativo de la jaula se puede observar. Jaulas de modelado como un efecto fijo no es estadísticamente válido, pero se menciona aquí para ilustrar una carencia de estudios de la jaula. La variabilidad de abejas entre las jaulas puede ser debido a una ausencia de reina, de cría, o otras señales ambientales que los empleados suelen encontrar en el ajuste de colmena natural. Se ha demostrado previamente que la feromona de contacto producida por las glándulas mandibulares de la reina suprime la biosíntesis JH en los trabajadores, lo que resulta en bajo título JH y un retraso en el inicio de forrajeo [44] , [45] . Por otra parte, en ausencia de cebador de feromona producidos por las larvas, edad enfermera-trabajadores tienen menor Vg en depósitos de grasa corporal [46] .Interacción entre los trabajadores también pueden afectar al desarrollo del comportamiento. En grupos de abejas que carecen de las personas mayores, el 5-10% se mostrará el desarrollo acelerado [47] . Si las abejas que expresan un fenotipo precoz, independientemente del tratamiento, estaban presentes en nuestras jaulas que pueden haber actuado en otras abejas para suprimir la síntesis de JH y la maduración del comportamiento [48] . La colocación de las abejas en jaulas sin los efectos moduladores de las feromonas reina y las crías no puede ser la mejor manera de estudiar los factores básicos que regulan el desarrollo del comportamiento.Los datos de las colonias de campo, que contiene una reina y las crías, representan mejor los efectos de N. ceranae infección en Vg y JH.

La tendencia positiva en relación transcripción Vg visto en las abejas infectadas en jaulas en el tiempo puede ser debido a la variabilidad entre jaulas o podría ser una respuesta del huésped inducida por parasitismo. Vitelogenina tiene propiedades que prolonga la vida, la protección de los trabajadores contra el estrés oxidativo [49] Nosema ceranae, como todos los microsporidios, carecen de mitocondrias o han relict mitocondrias-como las estructuras con ATP limitada una capacidad de producción;. por lo tanto, es característico de estos hongos a agregarse cerca sede de las mitocondrias para explotar endógeno ATP [50] . La infección puede resultar en la producción de millones de esporas en tan poco como 1-2 semanas [51] .Una abeja infectada puede responder a esta alta tasa de proliferación de hongos mediante el aumento de los niveles de Vg para contrarrestar tóxicas especies reactivas de oxígeno producidas a partir de las tasas de respiración elevadas en las células huésped infectadas del intestino medio [52] .

La alta mortalidad anual de las colonias de abejas en los EE.UU. y en todo el mundo debido a la exposición constante a las plagas de ácaros, la mala alimentación, pesticidas y patógenos se ha creado la necesidad de enfoques alternativos para evaluar la salud de las abejas. Los ensayos de diagnóstico que establecen la presencia / ausencia de enfermedad puede proporcionar información limitada acerca de la salud general de una colonia [53] , [54] . En la actualidad, el método estándar para el diagnóstico Nosema spp. infección es el de estimar el número medio de esporas por abeja por microscopía en una muestra compuesta de 50-100 abejas. En base a la investigación que aquí se presenta, puede ser más informativo para estimar la proporción de abejas infectadas en una colonia. Si pocas abejas están infectados, la reina puede poner huevos suficientes para reemplazar la pérdida, y las abejas no infectadas pueden conservar la flexibilidad para volver a la enfermera abeja fisiología y comportamiento según sea necesario. Por otro lado, si una alta proporción de abejas están infectadas, esta flexibilidad en el desarrollo del comportamiento puede deteriorarse, lo que lleva a la disminución de colonia. Como no fue eficiente en el tiempo para determinar la proporción de abejas infectadas, puede resultar beneficioso en futuras investigaciones para medir la salud y la productividad de la colonia mediante el examen endocrino genética, u otros marcadores bioquímicos. Específicamente, el muestreo para Vg o JH puede proporcionar un "historial médico" de la capacidad de una colonia para responder a la infección por patógenos o otros factores estresantes. Por ejemplo, la mala nutrición puede correlacionarse con los niveles globales bajos de Vg en edad enfermera-abejas, así como proporcionar una indicación de la capacidad antioxidante de los trabajadores [14] , [49] .

En una colonia de abejas, deterioro de la salud de los trabajadores a través de la infección, como hemos mostrado aquí, puede dar lugar a la alteración de rendimiento conductual y la muerte prematura. ¿Cómo la progresión de una enfermedad afecta el desempeño de tareas infecciosa y la productividad, no sólo de infectados, pero los trabajadores sanos, debe ser un objetivo de la investigación explorar más a fondo los problemas de salud de colonias de abejas.

Contribuciones de los autores

Concebido y diseñado los experimentos: MG MS. Realiza los experimentos: MG ZYH.Analizados los datos: MG. Contribuido reactivos / materiales / herramientas de análisis: ZYH.Escribió el documento: MG MS.

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Fuente: http://www.plosone.org